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重组草鱼干扰素对草鱼的免疫保护

作　者: 李东明
导　师: 吴志强; 胡成钰
学　校: 南昌大学
专　业: 动物学
关键词: 重组干扰素免疫保护干扰素刺激基因完整蛋白吸收药代动力学
分类号: S942.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是当今全球养殖产量最高的淡水鱼类之一,而我国的草鱼养殖产量为全球最高,其比重高达95.7%。现今鱼类养殖业通常采用高密度养殖模式,而这种模式却是造成鱼类疾病快速传播的主要因素之一。我国的草鱼养殖业因受GCHV感染导致草鱼出血病爆发,死亡率极高,给草鱼养殖业带来难以估量的经济损失。目前,鱼类疾病防治动辄大量使用化学药物和抗生素,结果不可避免地出现耐药性,并对环境造成严重污染。使用疫苗虽然可以有效防治某些特定疾病的发生,但这种方法存在抗病谱较窄的不足。作为变温脊椎动物的鱼类,其病毒防御体系主要有赖于其非特异性免疫系统。因此,应用具有广谱性抗病毒作用的干扰素,以降低各类疾病的发病风险的方法将不啻为一种理想的选择。本研究在前期成功克隆了一个草鱼Ⅰ型IFN基因(CiIFN)的基础上,构建了pET32a(+)-CiIFN重组质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,建立了一套稳定的重组草鱼干扰素(rCiIFN)原核表达与蛋白纯化系统。经SDS-PAGE测定,rCiIFN蛋白质相对分子质量约38kD,蛋白质浓度为750μg/mL,效价相当于5.7×103U/μg。以纯化后的rCiIFN制备兔多抗血清,通过间接ELISA法测得其效价大于50万。通过MTT还原法测定rCiIFN对草鱼肾细胞系CIK细胞的抗GCHV效果,结果显示rCiIFN的生物活性与其浓度存在一定的剂量依赖性。为评估rCiIFN在草鱼活体内抗GCHV感染效果,我们进行了腹腔注射和拌料投喂等两种不同途径对草鱼的免疫保护效果对比实验。将0.1、1、10μg/g鱼体重等三种不同剂量的rCiIFN经由腹腔注射免疫草鱼,以GCHV攻毒,结果表明,三种剂量都可以产生较好的免疫保护效力,但以1μg/g鱼体重的免疫剂量为最佳；另外,以每天拌料投喂rCiIFN总量为1μg/g鱼体重的剂量免疫草鱼1d、2d、5d,同样以GCHV攻毒,结果显示连续投喂2d的免疫组草鱼的相对存活率最高。本研究通过实时荧光定量PCR技术分析了rCiIFN对干扰素刺激基因(ISG)的诱导表达效果。体内和体外诱导实验结果均显示,rCiIFN可以显著性地提高ISG的转录表达水平。与对照组相比,草鱼CIK细胞的Mx和IFN的基因均显著上调表达,而且分别在6h和12h内达到峰值；与注射同等剂量PBS的对照组相比,在注射1μg/g鱼体重剂量的rCiIFN后,在草鱼肝、脾、肾、肠、鳃、心等组织中的IFN、IRF1、IRF7、Mx、PKR和STAT3等6种ISG也同样显著上调表达,其中大多数在12h内达到最高水平,在72h时基本上降低至本底水平；经拌料投喂1μg rCiIFN/g鱼体重剂量1d或连续投喂2-5d后,测定投喂不同时长的草鱼各组织的IFN基因的诱导表达情况,结果表明投喂1～2d的实验组草鱼各器官组织中IFN的诱导表达水平最高。本研究进一步就草鱼小肠不同区段对rCiIFN的吸收差异性进行了对比研究。以2μg/g鱼体重的剂量经口腔填喂草鱼消化道后,采用冰冻切片免疫组织化学方法检测并比较草鱼肠道不同区段在完整吸收具有生物活性的rCiIFN方面的差异性。结果表明,草鱼后肠比前肠具有更强的吸收rCiIFN能力。此外,本研究采用双抗夹心ELISA法分析了rCiIFN在草鱼血清中的药物代谢过程。以0.75μg/g鱼体重的剂量分别经腹腔注射途径或口服填喂后,在草鱼血清中分别于2h和3h时达到峰值,其大小分别为159.17pg/mL和79.06pg/mL随后在24h基本降低至本底水平。这种代谢特征大体上符合一级吸收、一级消除的药物代谢动力学规律。最后,本研究就rCiIFN的应用可行性进行了初步探索。CiiFN基因在重组菌中诱导表达时生成大量的包涵体,经包涵体变性与复性处理后,可以获得纯度较高的rCiIFN蛋白。5L发酵罐中试结果表明,重组菌仍可稳定地表达出大量的rCiIFN。吸附与溶解实验表明,颗粒饲料吸附rCiIFN的能力较强,且短时间内颗粒饲料所吸附的rCiIFN在水中的溶解损失较小。

重组草鱼干扰素对草鱼的免疫保护

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