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南极磷虾（Euphausia superba）抑菌活性肽的初步纯化及其作用机理研究

作　者: 赵玲
导　师: 魏玉西; 刘淇
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 南极磷虾 多肽 抑菌活性 抑菌机理
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


南极磷虾(Euphausia superba)是南极生态系统的关键物种,不但资源巨大,而且营养价值丰富具有高蛋白、低脂肪等特点,因而对该资源其高值化利用具有重要意义。本文以南极磷虾为研究对象,通过双酶酶解制备南极磷虾抑菌活性肽混合物,并对酶解工艺条件进行优化；采用Labscale小型切向流超滤系统、MSC300超滤杯和CM-52Carboxymethyl Cellulose阳离子交换层析对南极磷虾抑菌活性肽混合物进行初步纯化,并探讨了其抑菌机理。主要研究结论如下：1、南极磷虾蛋白酶解物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有明显的生长抑制作用,最佳酶解工艺为中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶水解,最适pH7.5,温度52.5℃,水解时间3h,双酶加酶量之比为2：5(w：w),双酶添加量为3000U/g底物。2、南极磷虾抑菌活性肽混合物经超滤、弱阳离子交换层析纯化后最终得到一个分子量范围在254-709D的混合肽(命名为CMCC-1),其最低抑菌浓度(MIC)为5mg/mL。3、抑菌机理研究结果表明：①CMCC-1在对数生长期能抑制金黄色葡萄球菌的菌体分裂；②培养液中蛋白和还原糖含量提高、电导率增加,且能检测到碱性磷酸酶和p-半乳糖苷酶的活性,说明菌体细胞壁和细胞膜可能被破坏,致使菌体通透性增强,大量胞内物质外泄；③经过扫描电镜对金黄色葡萄球菌菌体形态结构观察发现,随着CMCC-1处理时间的延长,加样组金黄色葡萄球菌菌体细胞形状变得不规则,菌体细胞表面粗糙,体积变小,大量的菌体细胞粘连在一起,大量胞内物质外溢,细胞之间的界限变得模糊不清,几乎融合为一个整体；④透射电镜下观察到,经CMCC-1处理后,金黄色葡萄球菌菌体表面变粗糙,细菌的繁殖能力受到抑制,菌体细胞壁变薄、细胞质固缩,内部空腔变大,菌体内含物大量外泄,不规则地分布在破碎菌体周围,菌体细胞最终裂解、死亡；⑤经SDS-PAGE分析,CMCC-1可导致菌体全蛋白谱带中部分谱带的缺失,剩余蛋白谱带也随着CMCC-1处理时间的延长而逐渐变浅。⑥基因组DNA电泳结果显示,经CMCC-1处理的金黄色葡萄球菌菌体基因组DNA条带虽没有呈弥散状,但亮度明显降低。根据以上实验结果推钡(?)CMCC-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用机理是破坏了菌体细胞壁和细胞膜,改变了细胞膜的通透性,导致大量胞内物质外泄,从而引起菌体死亡。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-9
引言  9-12
第一章 双酶酶解制备南极磷虾(Euphausia superba)抑菌蛋白酶解物  12-20
  1.1 实验试剂、仪器与材料  12-13
    1.1.1 试剂  12
    1.1.2 仪器  12-13
    1.1.3 材料  13
  1.2 方法  13-14
    1.2.1 南极磷虾抑菌蛋白酶解物的制备  13
    1.2.2 南极磷虾酶解条件优化  13-14
      1.2.2.1 蛋白酶筛选  13
      1.2.2.2 双酶组合试验  13-14
      1.2.2.3 正交试验  14
  1.3 结果与分析  14-19
    1.3.1 南极磷虾酶解物抑菌谱筛选结果  14-15
    1.3.2 单酶水解效果  15
    1.3.3 双酶组合效果  15-16
    1.3.4 双酶水解单因素试验结果  16-18
      1.3.4.1 温度  16
      1.3.4.2 pH  16-17
      1.3.4.3 酶解时间  17
      1.3.4.4 双酶添加量  17-18
      1.3.4.5 双酶的添加量比  18
    1.3.5 正交试验结果  18-19
  1.4 小结  19-20
第二章 南极磷虾抑菌活性肽的初步纯化及抑菌活性影响因素的研究  20-30
  2.1 实验试剂、仪器与材料  20
    2.1.1 试剂  20
    2.1.2 仪器  20
    2.1.3 材料  20
  2.2 实验方法  20-22
    2.2.1 相对分子质量测定  20-21
    2.2.2 多肽含量测定  21
    2.2.3 南极磷虾抑菌活性肽的分级纯化  21
    2.2.4 CM-52 Carboxymethyl Cellulose阳离子交换层析  21
    2.2.5 最低抑菌浓度(MIC)测定  21-22
    2.2.6 高效液相色谱测分子量分布  22
    2.2.7 温度对南极磷虾抑菌活性肽抑菌活性的影响  22
    2.2.8 pH对南极磷虾抑菌活性肽抑菌活性的影响  22
    2.2.9 储藏时间对南极磷虾抑菌活性肽抑菌活性的影响  22
    2.2.10 紫外线处理对南极磷虾抑菌活性肽抑菌活性的影响  22
  2.3 结果与分析  22-28
    2.3.1. 南极磷虾抑菌酶解物相对分子质量分布情况  22-23
    2.3.2 多肽含量测定结果  23
    2.3.3 各分级组分对金黄色葡萄球菌的抑菌活性  23-24
    2.3.4 CM-52 Carboxymethyl Cellulose离子交换层析  24-25
    2.3.5 最低抑菌浓度(MIC)  25
    2.3.6 CMCC-1的分子量分布范围  25-26
    2.3.7 温度对CMCC-1抑菌活性的影响  26
    2.3.8 pH对CMCC-1抑菌活性的影响  26-27
    2.3.9 储存时间对CMCC-1抑菌活性的影响  27-28
    2.3.10 紫外线处理对CMCC-1多肽抑菌活性的影响  28
  2.4 小结  28-30
第三章 南极磷虾抑菌活性肽CMCC-1的作用机理研究  30-47
  3.1 实验试剂、仪器与材料  30-31
    3.1.1 试剂  30
    3.1.2 仪器  30-31
    3.1.3 材料  31
  3.2 方法  31-33
    3.2.1 CMCC-1对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响  31
    3.2.2 CMCC-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞壁通透性的影响—碱性磷酸酶活性的测定  31
    3.2.3 CMCC-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞膜通透性的影响  31-33
      3.2.3.1 培养液中还原糖的测定  31-32
      3.2.3.2 培养液中蛋白含量的测定  32
      3.2.3.3 培养液中β-半乳糖苷酶的测定  32
      3.2.3.4 菌液电导率的测定  32-33
    3.2.4 扫描电镜样品的制备  33
    3.2.5 透射电镜样品的制备  33
    3.2.6 CMCC-1对金黄色葡萄球菌表达蛋白质的影响  33
    3.2.7 CMCC-1对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响  33
  3.3 结果与分析  33-45
    3.3.1 CMCC-1对金黄色葡萄球菌的生长曲线的影响  34
    3.3.2 CMCC-1对金黄色葡萄球菌离子通透性的影响—碱性磷酸酶活性的测定  34-35
    3.3.3 CMCC-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞膜通透性的影响  35-38
      3.3.3.1 培养液中还原糖的测定结果  35-36
      3.3.3.2 培养液中蛋白含量的测定结果  36-37
      3.3.3.3 培养液中β-半乳糖苷酶的含量测定结果  37-38
      3.3.3.4 电导率的测定结果  38
    3.3.4 菌体扫描电镜和透射电镜观察  38-44
      3.3.4.1 扫描电镜观察结果  38-41
      3.3.4.2 透射电镜观察结果  41-44
    3.3.5 CMCC-1对金黄色葡萄球菌菌体表达蛋白质的影响  44
    3.3.6 CMCC-1对金黄色葡萄球菌菌体基因组DNA的影响  44-45
  3.4 小结  45-47
结论  47-48
参考文献  48-52
综述  52-71
  1 南极磷虾  52-55
    1.1 南极磷虾的营养成分  52-53
    1.2 南极磷虾中的活性成分  53-55
      1.2.1 酶类  53
      1.2.2 紫外屏蔽物质—类菌孢素氨基酸  53-54
      1.2.3 虾青素  54
      1.2.4 甲壳素  54
      1.2.5 极性脂  54-55
      1.2.6 甾醇  55
  2 海洋生物活性物质  55-60
    2.1 天然存在的海洋活性肽  55-59
      2.1.1 抗肿瘤多肽  55-56
      2.1.2 抗菌肽  56-58
      2.1.3 抗病毒多肽  58
      2.1.4 肽类毒素  58-59
      2.1.5 肽类激素  59
    2.2 合成方法制备的活性肽  59-60
    2.3 蛋白质酶解的活性肽  60
  3 多肽的抑菌机理研究  60-62
    3.1 损伤细菌细胞壁  61
    3.2 改变细菌细胞膜的透性  61-62
    3.3 改变蛋白质及核酸分子  62
    3.4 干扰能量代谢系统  62
  展望  62-64
  参考文献  64-71
攻读学位期间的研究成果  71-72
致谢  72-73

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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