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扇贝补体相关分子的结构及功能研究

作　者: 王雷雷
导　师: 宋林生
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 海湾扇贝 栉孔扇贝 补体系统 免疫识别 固有免疫
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


补体系统是多细胞有机体内重要的免疫效应系统，在固有免疫防御中发挥重要作用。补体相关分子存在于多个无脊椎动物门类中，并参与了宿主的免疫防御。目前，软体动物补体相关分子以及补体激活途径的研究刚刚起步，亟待深入。本论文采用分子生物学、生物信息学和免疫学等多种技术，对栉孔扇贝（Chlamysfarreri）和海湾扇贝（Argopecten irradians）中的含C1q结构域蛋白（AiC1qDC-2，CfC1qDC-1和CfC1qDC-2）、含硫酯蛋白（CfTEP）、C型凝集素（AiCTL-9）以及纤维蛋白原相关蛋白（CfFREP）等补体相关分子进行了结构和功能的研究，探讨了它们在扇贝免疫系统中的作用。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子开放阅读框编码的蛋白序列中含有一个gC1q结构域，具有C1qDC蛋白家族典型的由十个β折叠片形成的球形结构以及特征氨基酸残基。RT-PCR检测结果显示AiC1qDC-2的mRNA主要在肝胰腺和性腺中表达，并且在扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显著上升。重组的AiC1qDC-2可结合LPS、PGN、Yeast-glucan和polyI：C等多种PAMPs，并可凝集Escherichia coli、Vibro anguillarum、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等微生物。利用RT-PCR技术检测了栉孔扇贝CfC1qDC-1mRNA的表达模式，发现LPS，PGN或β-glucan可显著上调血细胞中该分子的表达水平；在扇贝早期胚胎发育过程中该分子的表达量在D型幼虫期开始迅速上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光检测显示，CfC1qDC-1蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺、鳃、肾和性腺组织中。重组的CfC1qDC-1能够结合LPS、PGN、β-glucan、polyI:C以及人热聚集的IgG分子，并且与IgG的结合能力可以被LPS所阻断。此外，rCfC1qDC-1还能显著增强血细胞对E.coli的吞噬作用。高级结构分析表明CfC1qDC-1gC1q结构域表面带正电荷氨基酸残基的分布模式与人补体C1q ghB相似。利用RACE技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含三个典型的gC1q结构域，能够形成与人补体C1q相似的钟型三聚体高级结构。RT-PCR检测显示，CfC1qDC-2的mRNA在肝胰腺中表达量最高，在扇贝早期胚胎发育到D型幼虫时表达量开始显著上升，在眼点幼虫期达到最高表达水平；当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子mRNA的表达水平显著上升。重组的CfC1qDC-2具有广谱的配体结合谱，可结合6种不同类型PAMPs、8种微生物、扇贝凋亡细胞以及人热聚集IgG和IgM分子，并能抑制兔血清C1q依赖的溶血活性。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiCTL-9基因的cDNA序列全长，该分子所编码的氨基酸序列包含四个CTLD结构域，具有C型凝集素家族典型的结构和特征基序。RT-PCR检测显示，AiCTL-9的mRNA在肝胰腺和性腺中表达量较高，并且当扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显著上升。重组的AiCTL-9可结合LPS、β-glucan、MAN等多种PAMPs，凝集E. coli、V.angulillarum、B. subtili和Micrococcus buteus等微生物，还能显著增强血细胞的包囊化作用。利用同源克隆技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfFREP基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含一个FBG结构域，具有FREP家族典型的结构和特征序列。RT-PCR检测结果显示，当扇贝受到LPS或PGN刺激后，血细胞中CfFREPmRNA的表达量均显著上升。免疫荧光显示CfFREP蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺，鳃，肾以及血细胞周围。重组的CfFREP可结合LPS、PGN、β-glucan和polyI:C，但无凝菌活性。利用RT-PCR技术对栉孔扇贝CfTEP mRNA的检测结果显示，当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子的表达量均显著上升；在扇贝早期胚胎发育过程中，该分子的表达量从D型幼虫期开始显著上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光表明CfTEP蛋白主要分布于扇贝肝胰腺、鳃、肾、性腺和外套膜中，并且在D型幼虫、面盘幼虫和眼点幼虫外围也均有分布。Westernblotting显示CfTEP蛋白在扇贝血清中以断裂的片段形式存在，并且当注射甲胺使体内TEP失活后，扇贝在V. angulillarum侵染后的存活率明显下降。对以上六个扇贝补体相关分子的研究表明，它们与高等动物补体分子C1q、C3、ficolin或MBL在结构上存在相似，并具有高等动物补体分子类似的功能，可作为模式识别受体参与免疫识别，抑或作为效应分子参与病原清除，同时，具有结合高等动物免疫球蛋白和扇贝凋亡细胞的能力。该研究结果表明补体相关分子可能作为原始补体系统的组分参与扇贝的固有免疫防御，为阐明补体相关分子的进化脉络以及丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供了分子生物学证据。

全文目录


致谢  4-5
摘要  5-8
ABSTRACT  8-16
第一章 文献综述  16-38
  第一节 无脊椎动物的固有免疫系统  16-20
    一、免疫识别  16-18
      1 PAMPs  17
      2 PRRs  17-18
    二、免疫信号的调整和放大  18-19
    三、免疫效应  19-20
  第二节 补体系统概述  20-26
    一、补体成分  20-21
    二、补体系统的不同途径  21-25
      1 经典途径  22
      2 凝集素途径  22-23
      3 替代途径  23-24
      4 终末途径  24-25
      5 其他途径  25
    三、补体系统的生物学功能  25-26
  第三节 无脊椎动物补体系统研究概况  26-35
    一、无脊椎动物补体相关分子的研究  27-34
      1 补体中心分子 C3 的研究  27-29
      2 补体系统起始分子的研究  29-32
        （1）C1q 分子  29-31
        （2）MBL/Ficolin  31-32
      3 补体相关含丝氨酸蛋白酶结构域分子的研究  32-33
        （1）B 因子/C217  32
        （2）MASP/C1r/C1s  32-33
      4 其他分子的研究  33-34
    二、无脊椎动物中补体激活途径的研究  34-35
  第四节 贝类补体系统研究的目的和意义  35-38
第二章 实验材料与方法  38-54
  第一节 实验材料  38-41
    一、实验中所用的动物和菌株的准备  38
    二、主要生物试剂及仪器设备  38-39
    三、实验样品的处理及取样  39-41
  第二节 实验方法  41-54
    一、扇贝 RNA 的提取及 cDNA 的合成  41
    二、RACE 技术获取基因的完整 cDNA 序列  41-42
    三、Real-time 荧光 PCR 检测基因表达  42
    四、序列与结构特征分析  42-43
    五、蛋白原核重组表达及纯化  43-46
    六、多克隆抗体的制备  46
    七、Western blotting 分析  46
    八、免疫荧光组织化学分析  46-48
    九、重组蛋白的 PAMPs 结合活性分析  48-49
    十、重组蛋白的菌结合活性分析  49-50
    十一、重组蛋白的凝菌活性分析  50
    十二、重组蛋白的免疫球蛋白结合活性分析  50-51
    十三、重组蛋白对扇贝血细胞的促吞噬活性分析  51
    十四、重组蛋白对扇贝血细胞的促包囊化活性分析  51-52
    十五、重组蛋白对扇贝凋亡细胞的结合活性分析  52
    十六、重组蛋白对哺乳动物血细胞溶血抑制活性分析  52-53
    十七、甲胺失活 TEP 蛋白后栉孔扇贝在鳗弧菌感染后的存活率测定  53-54
第三章 实验结果与讨论  54-104
  第一节 扇贝单结构域 C1QDC 蛋白的研究  54-69
    一、实验结果  54-65
      1 海湾扇贝 AiC1qDC-2 的基因克隆及功能研究  54-59
        （1）AiC1qDC-2 基因的克隆及同源序列比对  54-56
        （2）AiC1qDC-2 的 mRNA 的组织表达模式  56
        （3）AiC1qDC-2 的 mRNA 对不同微生物刺激的响应  56-57
        （4）AiC1qDC-2 的原核重组表达及抗体制备  57
        （5）AiC1qDC-2 重组蛋白对不同 PAMPs 的结合活性  57-58
        （6）AiC1qDC-2 重组蛋白对不同微生物的凝集活性  58-59
      2 栉孔扇贝 CfC1qDC-1 的结构及功能研究  59-65
        （1）CfC1qDC-1 的 mRNA 在不同 PAMPs 刺激后的表达模式  59-60
        （2）CfC1qDC-1 的 mRNA 在栉孔扇贝不同发育时期的表达模式  60-61
        （3）CfC1qDC-1 的原核重组表达及抗体制备  61
        （4）CfC1qDC-1 蛋白在栉孔扇贝不同组织中的分布  61-62
        （5）CfC1qDC-1 重组蛋白的 PAMPs 结合活性  62-63
        （6）CfC1qDC-1 重组蛋白对人热聚集 IgG 的结合活性  63
        （7）CfC1qDC-1 重组蛋白对栉孔扇贝血细胞的促吞噬活性  63
        （8）CfC1qDC-1 gC1q 结构域的高级结构及系统进化树  63-65
    二、讨论  65-69
  第二节 扇贝多结构域 C1QDC 蛋白的研究  69-80
    一、实验结果  69-77
      1 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 的基因克隆及序列同源比对  69-70
      2 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 的高级结构预测  70-71
      3 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 的 mRNA 在不同组织和发育时期的表达模式  71-72
      4 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 的 mRNA 在不同 PAMPs 刺激后的表达模式  72-73
      5 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 的原核重组表达及抗体检测结果  73
      6 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 重组蛋白的 PAMPs 结合活性  73-75
      7 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 重组蛋白的菌结合活性  75
      8 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 重组蛋白对凋亡细胞的结合活性  75-76
      9 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 重组蛋白对人热聚集 IgG 和 IgM 的结合活性  76
      10 栉孔扇贝 CfC1qDC-2 重组蛋白的抑制兔血清 C1q 依赖的溶血活性  76-77
    二、讨论  77-80
  第三节 扇贝 C 型凝集素(AICTL-9)和纤维蛋白原相关蛋白(CFFREP)的研究  80-96
    一、实验结果  80-92
      1 海湾扇贝 AiCTL-9 的基因克隆及功能研究  80-87
        （1）AiCTL-9 基因的克隆，同源序列比对以及高级结构  80-83
        （2）AiCTL-9 的 mRNA 在海湾扇贝不同组织中的分布  83
        （3）AiCTL-9 的 mRNA 对不同微生物刺激的响应  83-84
        （4）AiCTL-9 的原核重组表达及抗体制备  84-85
        （5）AiCTL-9 重组蛋白对不同 PAMPs 的结合活性  85
        （6）AiCTL-9 重组蛋白对不同微生物的凝集活性  85
        （7）AiCTL-9 重组蛋白促进血细胞的包囊化作用  85-87
      2 栉孔扇贝 CfFREP 的基因克隆及功能研究  87-92
        （1）CfFREP 基因的同源克隆及同源序列比对  87-89
        （2）CfFREP 的 mRNA 在不同 PAMPs 刺激后的表达模式  89
        （3）CfFREP 重组蛋白的表达及多克隆抗体的制备  89-90
        （4）CfFREP 重组蛋白具有 PAMPs 的结合活性但无凝聚活性  90
        （5）CfFREP 蛋白在栉孔扇贝不同组织的分布  90-92
    二、讨论  92-96
  第四节 栉孔扇贝含硫酯蛋白（CFTEP）的研究  96-104
    一、实验结果  96-100
      1 栉孔扇贝 CfTEP 的 mRNA 对不同 PAMPs 刺激的表达模式  96
      2 栉孔扇贝 CfTEP mRNA 在不同发育时期的表达模式  96-97
      3 栉孔扇贝 CfTEP 部分片段的原核重组表达及多克隆抗体制备  97
      4 栉孔扇贝 CfTEP 蛋白在血清中的存在形式  97-98
      5 栉孔扇贝 CfTEP 蛋白在不同组织中的分布  98-99
      6 栉孔扇贝 CfTEP 蛋白在早期幼虫中的分布  99-100
      7 甲胺失活 TEP 蛋白后栉孔扇贝在鳗弧菌感染后的存活率变化  100
    二、讨论  100-104
第四章 结论  104-108
第五章 博士期间的其他工作  108-126
  第一节 中华绒螯蟹 C 型凝集素 ESCTL 的研究  108-118
    一、研究背景  108-109
    二、实验方法  109
    三、实验结果  109-116
      1 EsCTL 的序列特征、同源比对、进化树以及高级结构  109-112
      2 EsCTL 的 mRNA 在不同组织以及微生物刺激后的表达模式  112-113
      3 EsCTL 的重组蛋白及抗 MBP 标签抗体的特异性检测结果  113
      4 EsCTL 重组蛋白的 PAMPs 结合活性  113-115
      5 EsCTL 重组蛋白对不同微生物的结合活性  115
      6 EsCTL 重组蛋白促进血细胞的包囊化作用  115-116
    四、讨论  116-118
  第二节 中华绒螯蟹抗脂多糖因子 ESALF-3 的研究  118-126
    一、研究背景  118-119
    二、实验方法  119
    三、实验结果  119-124
      1 EsALF-3 的序列特征、同源比对、进化树以及高级结构  119-121
      2 EsALF-3 的 mRNA 在不同组织中的分布模式  121-122
      3 EsALF-3 的原核重组蛋白  122
      4 EsALF-3 重组蛋白的抗菌活性  122-124
    四、讨论  124-126
参考文献  126-156
附录：本论文所用引物序列  156-158
作者简历  158-160
硕博连读期间完成和发表的论文  160-162

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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