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栉孔扇贝、海湾扇贝热休克蛋白22基因的克隆和表达及其与栉孔扇贝抗热性状相关SNP位点的筛查

作　者: 张蕾
导　师: 杨官品；宋林生
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 栉孔扇贝海湾扇贝热休克蛋白22 重金属鳗弧菌高温应激实时定量PCR 单核苷酸多态性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

贝类养殖是我国传统的海水养殖产业,在海水养殖中占重要地位。但从上世纪90年代以来,养殖贝类陆续开始出现大规模死亡现象,经济损失惨重。养殖贝类的大规模流行性死亡是外界病原、环境变化和扇贝生物本身等多方面因素相互作用的结果。目前围绕病原分离鉴定、改善养殖环境和优化养殖技术及培育优良品种的方面已经开展大量的研究工作,收到了一定的成效。本研究采取大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从栉孔扇贝和海湾扇贝cDNA文库中分离、克隆了热休克蛋白22基因,并采用实时定量PCR技术检测了HSP22基因的表达特征,并以克隆获得的栉孔扇贝HSP22基因为候选基因,研究了其多态性与栉孔扇贝高温抗性的关系。具体结果如下:海湾扇贝热休克蛋白22基因(AiHSP22)的cDNA全长为1112 bp,包含5’非翻译区(UTR)51 bp,588 bp的开放阅读框(ORF),473 bp的3’UTR,最后为22个腺嘌呤的Poly A尾巴。开放阅读框编码195个氨基酸的多肽,该多肽的估计分子量为22.71kD,估计的等电点为8.44。经BLAST比对,AiHSP22与其他物种的HSP22蛋白有较高的相似性。SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)软件分析,AiHSP22包含典型的小热休克蛋白家族的特征结构:α-晶体球蛋白结构域。利用Real-time RT-PCR发现AiHSP22 mRNA在海湾扇贝体内普遍存在于血细胞、肌肉、肾脏、性腺、鳃和心组织中,其中在心和肌肉的表达量最高,血细胞中表达量最低。同样用实时定量PCR检测海湾扇贝HSP22基因对铜、铅和镉三种重金属刺激的响应,发现AiHSP22 mRNA的表达量并未随着三种重金属浓度的提高而呈线性增加,且AiHSP22对镉刺激的敏感性要远低于铜和铅。研究结果为进一步开发海湾扇贝HSP22作为一种监测水体重金属污染的生物标记物提供了借鉴。栉孔扇贝热休克蛋白22基因(CfHSP22)的cDNA全长为1279 bp,包含5’UTR 122 bp,576 bp的开放阅读框,3’UTR 581 bp,最后是32个腺嘌呤的poly A尾巴。CfHSP22的开放阅读框编码191个氨基酸的多肽,该多肽的估计分子量为22.1kD,估计的等电点为9.69,经BLAST比对,CfHSP22与AiHSP22的相似性达79%,与其他物种的HSP22也有较高相似性。SMART软件分析,CfHSP22也包含典型的小热休克蛋白家族的特征结构:α-晶体球蛋白结构域。利用Real-time RT-PCR,发现CfHSP22在各组织普遍存在,在肝胰腺中的表达最高,在血细胞中表达量最低。在鳗弧菌刺激下,栉孔扇贝血细胞中HSP22 mRNA的表达量显著升高,表达量随时间的延长而增加,刺激后12小时达到最高值,随后逐渐下降。结果表明栉孔扇贝的热休克蛋白22基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。根据30℃高温刺激下栉孔扇贝的死亡情况筛选出了抗热和热敏感的扇贝群,通过不同扇贝CfHSP22基因的多态性分析,在其编码区发现一个非同义突变的SNP位点:+94 C/ A颠换。采用Bi-PASA PCR分析方法发现该位点出现三种基因型:野生型CC,杂合性CA和突变型CA,三种基因型与栉孔扇贝抗热性状相关的统计分析结果显示,+94AA基因型和+94CA基因型在抗热群体中的频率显著高于敏感群体(P<0.05),表明两种基因型可能与栉孔扇贝对高温的抗性相关。为验证这一相关性,高温刺激具有+94AA基因型、+94CA基因型和+94CC基因型的扇贝个体后进行死亡率分析,结果显示,具有+94AA基因型的扇贝死亡率极显著低于+94CC基因型的扇贝(P<0.01),具有+94CA基因型的扇贝死亡率显著低于+94CC基因型的扇贝(P<0.05)。研究结果进一步证实热休克蛋白22基因+94 C/ A颠换多态性与栉孔扇贝对高温的敏感性/抗性相关,为+94 C/ A颠换作为一个潜在的分子标记应用于栉孔扇贝抗热性状的选择育种奠定了理论基础。

栉孔扇贝、海湾扇贝热休克蛋白22基因的克隆和表达及其与栉孔扇贝抗热性状相关SNP位点的筛查

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