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贝氏隐孢子虫鸡胚气管组织培养模型建立与初步应用

作　者: 张素梅
导　师: 张龙现; 宁长申
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 贝氏隐孢子虫鸡胚气管环 SYBR-Green I实时定量PCR 鸡胚硝唑尼特巴龙霉素
分类号: S858.31
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

贝氏隐孢子虫(Crptosporidium baileyi,C. baileyi)是世界各地禽类感染的优势虫种,可感染30多种禽类,导致雏鸡较高发病率和一定死亡率,研究者通过扫描电镜观察发现在感染雏鸡气管上皮细胞上粘附有大量各发育阶段虫体,可引起禽类严重呼吸道感染。更重要的是C. baileyi可污染环境并通过水、食物、空气传播。有研究表明在中国上海生活废水中已发现C. baileyi卵囊。C. baileyi卵囊对环境抵抗力很强,保存在4℃2.5%重铬酸钾溶液中18个月的卵囊仍可引起雏鸡明显感染。目前,对于隐孢子虫病尚无有效防控药物,研究表明抗球虫药物单独或联合使用均不能减轻或治疗由该病原引起的呼吸道症状。此外,通过免疫印迹和免疫荧光检测,C. baileyi和C. parvum在抗原上的相似性高于C. muris。因此,研究C. baileyi具有重要的医学和兽医学价值,并且对C. baileyi生物学等特性研究可作为其他隐孢虫研究模型。雏鸡感染C. baileyi后繁殖大量卵囊用于生物学试验研究,有助于阐明C. parvum的生物学特性。自1983年开始,人们开始尝试体外培养隐孢子虫,但至目前为止,关于禽类隐孢子虫体外细胞培养研究较少。有研究证明:完整的C. baileyi体外发育只在鸡、火鸡、鸭、鹧鸪、鹌鹑胚内完成。由于在实验感染雏鸡呼吸道内通过电镜观察可看到C. baileyi有性和无性内生发育阶段,并且C. baileyi在一些禽类和哺乳动物的原代细胞和一些哺乳动物传代细胞系内不发育,而在鸡胚内发育但不利于实验观察,所以本研究尝试用鸡胚气管组织培养模型培养C. baileyi。本试验将C. baileyi卵囊和子孢子混合物或子孢子接种鸡胚气管环,通过观察气管环接种虫体后纤毛摆动强弱、虫体内生发育过程,了解C. baileyi在鸡胚气管环培养模型中虫体的发育状况及繁殖数量,并建立了鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。此外,应用建立的气管环培养体系试验性比较了硝唑尼特(Nitazoxanide, NTZ)和巴龙霉素(Paromomycin ,PRM)对气管环和鸡胚培养模型中C. baileyi的作用,为今后研究C. baileyi毒力、感染性、代谢途径、内源和外源基因表达、治疗药物筛选等奠定了基础。一、C. baileyi卵囊纯化、脱囊技术研究将自河南林州自然感染隐孢子虫病鸡分离的虫体基于18S rRNA基因巢式PCR-RFLP鉴定后卵囊经雏鸡传代扩增。将鸡粪收集混匀,采用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊,用1:1.2、1:1.5、1:2三个梯度不连续蔗糖溶液密度梯度离心法(饱和蔗糖溶液和蒸馏水的体积比)进行纯化。纯化后卵囊用0.5%商用次氯酸钠(PBS工作液10倍稀释)4℃处理10 min后用灭菌并含200 IU/mL双抗的PBS工作液无菌清洗4次除去次氯酸钠,加入含200 IU/mL双抗的DMEM培养基计数后用于气管环培养。同时,本试验比较了由不同浓度胰酶和胆酸盐组成的5种脱囊液分别在38～40℃水浴中脱囊不同时间的脱囊率。子孢子用孔径为5μm双层聚碳酸酯过滤纯化,血细胞计数板计数后使用。结果显示:用1:1.2、1:1.5、1:2(2次)蔗糖溶液纯化的贝氏隐孢子虫卵囊在不含胰酶和胆酸盐的DMEM培养液中40℃水浴脱囊率最高,达77%。二、C. baileyi鸡胚气管环体外培养模型建立将C. baileyi卵囊和子孢子感染鸡胚气管环,气管环置于24孔培养板内,每孔1个环,每孔加1mL含2.5%热灭活血清DMEM培养液,于40℃5% CO2培养,每组10个气管环。第Ⅰ组接种约5×104个C. baileyi卵囊40℃水浴脱囊后混合物,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别接种5×105、1×106、2×106个纯化子孢子,第Ⅴ组不接种虫体作为空白对照。经过特定时间培养后结果显示:(1)鸡胚气管环感染鸡源贝氏隐孢子虫后6~9 d,各感染组(第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)气管环纤毛脱落明显比空白对照组多,纤毛摆动活性减弱。统计结果显示:各感染组气管环纤毛上皮细胞纤毛摆动相对活力与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。(2)接种虫体后第4 d,在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各感染组培养液内发现平均大小为6.5μm×0.9μm的子孢子或裂殖子样左右摆动虫体。接种虫体后第6 d,可观察到平均大小约为3.5μm×3.5μm的裂殖体样虫体。在接种子孢子的第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各感染组培养液内没有发现新生卵囊(第Ⅰ组因接种卵囊脱囊后混合物未进行观察)。(3)通过电镜和间接免疫荧光检查发现:虫体寄生在气管环纤毛上皮细胞边缘,虫体寄生部位纤毛倒伏,甚至脱落,通过PCR-RFLP分析寄生虫体为C. baileyi。三、鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法建立为了测定鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi发育动态,并评价硝唑尼特(NTZ)和巴龙霉素(PRM)对该培养体系中C. baileyi的作用,本试验建立了鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。该方法同时测定虫体和鸡胚气管环组织细胞18S rRNA基因,采用相对定量法计算组织细胞中虫体相对量。具体为将约5×104 C. baileyi个卵囊40℃水浴脱囊后混合物接种于培养在24孔培养板内鸡胚气管环,每孔1个环,加1 mL含2.5%热灭活血清DMEM培养液于40℃5% CO2培养。分别提取接种后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192h、240 h以及NTZ和PRM作用后72 h、96 h、120 h、168 h气管环细胞基因组DNA,应用实时定量PCR检测方法测定虫体繁殖水平。结果显示:C. baileyi感染鸡胚气管环后72～96 h虫体量最高,96 h以后虫体量开始明显下降。NTZ和PRM对鸡胚气管环培养模型中C. baileyi具有一定抑制作用,且这2种药物的抑制作用强度差异具有统计学意义(P<0.05)。四、鸡胚培养模型中NTZ和PRM抗C. baileyi活性研究为了探讨NTZ和PRM对鸡胚培养模型中C. baileyi的作用,将10日龄SPF鸡胚每枚接种3×105个C. baileyi卵囊,每组10枚鸡胚,40℃培养7 d,每天记录鸡胚和虫体的发育及虫体数量来评价NTZ和PRM在鸡胚培养模型中抗隐孢子活性。结果表明:每枚鸡胚分别加入125μg NTZ和10 mg PRM,感染168 h后尿囊液中平均卵囊数分别为对照组的0.33% (0.04/12.11),2.48% (0.30/12.11),NTZ和PRM对鸡胚培养模型中C. baileyi抑制作用效果不同于气管环培养模型中效果,且药效差异比较具有统计学意义(P<0.01)。

全文目录

致谢  4-10
摘要  10-14
文献综述  14-38
  1 隐孢子虫体外培养研究进展  17-22
    1.1 人源孢子虫体外培养研究进展  18-19
    1.2 禽源孢子虫体外培养研究进展  19
    1.3 其他动物源孢子虫体外培养研究进展  19-22
  2 鸡气管组织体外培养模型研究进展  22-30
    2.1 鸡气管组织培养在病原研究中应用  22-25
    2.2 鸡气管组织培养模型在其他方面的应用  25-28
    2.3 鸡气管组织培养方法和条件研究  28-30
  3 体外培养模型中隐孢子虫检测方法研究进展  30-38
    3.1 显微计数法  30-31
    3.2 酶免疫检测法（EIA）  31-32
    3.3 分子和其他方法  32-38
试验一 C. baileyi 地方分离株扩增、纯化与脱囊  38-48
  引言  38
  1 材料与方法  38-41
    1.1 材料  38-39
    1.2 方法  39-41
      1.2.1 卵囊接种  39
      1.2.2 卵囊收集  39-40
      1.2.3 卵囊纯化  40
      1.2.4 卵囊脱囊  40
      1.2.5 不同组成脱囊液和脱囊条件对脱囊率的影响  40-41
  2 结果与分析  41-44
    2.1 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊扩增  41
    2.2 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊纯化  41-43
    2.3 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊脱囊  43-44
  3 结论与讨论  44-48
    3.1 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊扩增  44
    3.2 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊纯化  44-45
    3.3 鸡源贝氏隐孢子虫卵囊脱囊  45-47
    3.4 结论  47-48
试验二 C. baileyi 鸡胚气管环体外培养模型建立  48-62
  引言  48
  1 材料与方法  48-53
    1.1 主要试剂及材料  48-50
    1.2 方法  50-53
      1.2.1 培养基配制  50
      1.2.2 卵囊与子孢子纯化  50
      1.2.3 气管环制备  50-51
      1.2.4 虫体接种与培养  51
      1.2.5 气管环纤毛活力评价体系与观测指标  51
      1.2.6 鸡胚气管环接种卵囊后组织学检查  51-52
      1.2.7 间接免疫荧光检查  52-53
      1.2.8 PCR-RFLP 分析  53
  2 结果与分析  53-58
    2.1 鸡胚气管环培养模型中虫体发育史观察  53
    2.2 虫体感染鸡胚气管环后对纤毛摆动活性的影响  53-54
    2.3 鸡胚气管环感染贝氏隐孢子虫后组织学与间接免疫荧光检查  54-56
    2.4 鸡胚气管环感染贝氏隐孢子虫后电镜检查  56-57
    2.5 鸡胚气管环感染贝氏隐孢子虫后 PCR-RFLP 检测  57-58
  3 结论与讨论  58-62
    3.1 鸡胚气管环体外培养模型中隐孢子虫发育史观察  58-59
    3.2 虫体分离株与培养条件对虫体体外培养的影响  59
    3.3 鸡胚气管组织培养  59-60
    3.4 结论  60-62
试验三鸡胚气管环体外培养体系中C.baileyi SYBR GreenⅠ实时定量PCR 检测方法建立与应用  62-76
  引言  62-63
  1 材料与方法  63-67
    1.1 材料  63
    1.2 方法  63-67
      1.2.1 引物设计及合成  63-64
      1.2.2 引物特异性初步分析  64-65
      1.2.3 气管环制备与虫体接种  65-66
      1.2.4 样品 DNA 提取与测定  66
      1.2.5 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 反应体系条件优化  66
      1.2.6 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 扩增及标准曲线的建立  66-67
      1.2.7 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 敏感性测定  67
      1.2.8 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 重复性测定  67
      1.2.9 鸡胚气管环培养模型中 C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量 PCR 检测  67
  2 结果与分析  67-72
    2.1 引物特异性初步分析结果  67-68
    2.2 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 引物反应性确认  68-69
    2.3 退火温度优化  69
    2.4 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 标准曲线  69-71
    2.5 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR敏感性测定结果  71
    2.6 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR重复性测定结果  71
    2.7 鸡胚气管环培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果  71-72
  3 结论与讨论  72-76
    3.1 关于鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量 PCR检测方法的建立  72-73
    3.2 建立标准曲线用卵囊显微计数  73
    3.3 鸡胚气管环体外培养模型中 C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量 PCR 检测方法验证  73-74
    3.4 相对定量法在鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi SYBR GreenⅠ实时定量PCR 检测中的应用  74
    3.5 关于样品中 DNA 提取  74
    3.6 基于SYBR GreenⅠ实时定量PCR 检测法测定的鸡胚气管环体外培养模型中C. baileyi 发育动态  74-75
    3.7 基于SYBR GreenⅠ实时定量PCR 测定硝唑尼特和巴龙霉素对鸡胚气管环体外培养模型中 C. baileyi 发育的影响  75
    3.8 结论  75-76
试验四硝唑尼特和巴龙霉素对鸡胚培养模型中C. baileyi作用  76-86
  引言  76
  1 材料与方法  76-78
    1.1 材料  76-77
    1.2 方法  77-78
      1.2.1 卵囊扩增  77
      1.2.2 卵囊纯化  77
      1.2.3 卵囊计数  77
      1.2.4 药物毒性试验  77
      1.2.5 鸡胚试验分组  77-78
      1.2.6 鸡胚观察指标与方法  78
  2 结果与分析  78-84
    2.1 药物毒性试验  78
    2.2 NTZ 和 PRM 对 C. baileyi 在鸡胚培养模型中发育影响  78-79
    2.3 NTZ 和 PRM 对 C. baileyi 在鸡胚培养模型中增殖影响  79-84
  3 结论与讨论  84-86
    3.1 关于鸡胚培养模型在隐孢子虫培养中的应用  84
    3.2 NTZ 和 PRM 对 C. baileyi 鸡胚培养模型中发育影响  84
    3.3 NTZ 和 PRM 对 C.bailey 在鸡胚培养模型中增殖影响  84-85
    3.4 NTZ 和 PRM 对鸡胚培养模型和气管环培养模型中 C . b a i ley i 作用比较  85
    3.5 结论  85-86
结论与创新点  86-88
参考文献  88-104
英文摘要  104-110
附录  110-113
  附录 A 攻读博士期间科研工作  110-112
  附录 B 缩略词表  112-113

贝氏隐孢子虫鸡胚气管组织培养模型建立与初步应用

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