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基于HPPRRSV N蛋白的快速免疫检测方法的建立与应用

作　者: 姚瑶
导　师: 赵宝华
学　校: 河北师范大学
专　业: 微生物学
关键词: PRRSV 核衣壳蛋白单克隆抗体胶体金试纸
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 33次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)，最早出现于欧洲，并于90年代初期在美国首次发现，从此，PRRSV就成为世界养猪业中的一大难题。PRRSV能引起猪的繁殖障碍以及其他疾病例如呼吸问题、体重减少和成长问题。本研究通过复苏实验室构建的重组菌株BL21(DE3)(pET-N)，经限制性内切酶EcoRI、BamHI双酶切鉴定可用后，在先前优化好的条件下诱导重组菌株BL21(DE3)(pET-N)6小时，大量且稳定的表达HPPRRSV中的核衣壳（N）蛋白；随后对核衣壳蛋白进行镍柱纯化，以及Western blot实验检测，结果证明：该质粒上确实拥有ORF7基因，并且该基因插入至正确位置，pET-N质粒正确。纯化后的重组核衣壳蛋白的纯度大于90%；Westernblot结果显示：17kD处出现明显的反应条带，这表示重组的核衣壳蛋白具有良好的特异性和免疫原性。通过对间接ELISA实验中的抗原包被浓度、包被时间、封闭时间、封闭试剂、血清作用稀释倍数、二抗作用时间与稀释倍数等条件的优化，建立间接ELISA实验方法，并确定该方法的临界值、特异性、敏感性、变异系数及保质期。结果证明，建立的间接ELISA方法可以用于检测猪血清中抗N蛋白的抗体，且无明显交叉反应。利用N蛋白对小鼠进行免疫，当小鼠血清效价达到50000以上之后，进行细胞融合实验，使用间接ELISA方法筛选出9株针对N蛋白的细胞株和2株针对组氨酸标签的细胞株。采用辛酸硫酸铵方法纯化抗体后鉴定抗体亚型均为IgG型；抗体可以与PRRSV商品化试剂盒中的PRRSV抗原结合并得到阳性结果，与其他常见病毒无交叉反应。说明所得9株抗体的特异性很好。在得到质量良好的胶体金溶液后，优化了金标抗体的最适pH和最适标记量、兔抗PRRSV N蛋白抗体、兔抗鼠IgG的最佳包被量，并按筛选的用量在玻璃纤维素膜进行喷金，作为金标垫，在硝酸纤维素膜上分别包被兔抗PRRSV N蛋白抗体、兔抗鼠IgG作为检测线（T）和质控线（C）。按照文献的方法组装胶体金试纸条，检测其敏感性和特异性，为PRRSV的快速检测奠定基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 文献综述  11-27
  1.1 PRRSV 病原学  11-19
    1.1.1 PRRSV 一般特征  11-12
    1.1.2 PRRSV 的非结构蛋白与结构蛋白及其特征  12-19
  1.2 PRRSV 免疫学  19-23
    1.2.1 靶细胞以及 PRRSV 的细胞受体  19
    1.2.2 对于 PRRSV 的先天性免疫  19-22
    1.2.3 对 PRRSV 的适应性免疫  22-23
  1.3 诊断方法  23-27
    1.3.1 临床诊断  23-24
    1.3.2 病毒分离  24
    1.3.3 血清学检测  24-26
    1.3.4 分子生物学诊断技术  26-27
2 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 N 蛋白的表达和纯化  27-35
  2.1 材料与方法  27-32
    2.1.1 材料  27-30
    2.1.2 方法  30-32
  2.2 结果  32-34
    2.2.1 BL21(DE3)(pET-N)中重组质粒双酶切结果  32-33
    2.2.2 核衣壳（N）蛋白的诱导以及表达  33
    2.2.3 核衣壳（N）蛋白的纯化  33
    2.2.4 纯化后 N 蛋白的 Western blot  33-34
  2.3 小结  34-35
3 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 N 蛋白间接 ELISA 的建立以及条件优化  35-44
  3.1 材料与方法  35-39
    3.1.1 材料  35-36
    3.1.2 方法  36-39
  3.2 结果  39-43
    3.2.1 血清最佳稀释倍数与 N 蛋白抗原包被最佳浓度  39
    3.2.2 N 蛋白抗原包被最佳条件  39
    3.2.3 封闭液选择种类及合适浓度  39-40
    3.2.4 最适封闭时间  40
    3.2.5 兔抗猪 IgG 最适工作浓度  40
    3.2.6 兔抗猪 IgG 孵育时间的确定  40-41
    3.2.7 ELISA 临界值的确定  41-42
    3.2.8 特异性检测结果  42
    3.2.9 敏感性测定结果  42
    3.2.10 批内的检测实验  42
    3.2.11 批间的检测实验  42-43
    3.2.12 保质期实验  43
  3.3 小结  43-44
4 抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 N 蛋白单克隆抗体的制备  44-53
  4.1 材料与方法  44-49
    4.1.1 材料  44-45
    4.1.2 方法  45-49
  4.2 结果  49-52
    4.2.1 小鼠免疫之后的血清效价  49-50
    4.2.2 细胞融合以及亚克隆结果  50
    4.2.3 单克隆抗体的纯化和浓度  50-51
    4.2.4 细胞上清、纯化前抗体和纯化后抗体效价测定  51
    4.2.5 单克隆抗体亚型的鉴定  51-52
    4.2.6 单克隆抗体的特异性  52
  4.3 小结  52-53
5 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金试纸条的制备  53-60
  5.1 材料与方法  53-56
    5.1.1 材料  53-54
    5.1.2 方法  54-56
  5.2 结果  56-59
    5.2.1 胶体金的质量检测  56
    5.2.2 McAb（4G3A1）最适 pH 的确定  56-57
    5.2.3 McAb（4G3A1）最适标记量的确定  57
    5.2.4 金标抗体 4G3A1 的制备流程  57
    5.2.5 金标 McAb（4G3A1）最适稀释倍数的确定  57-58
    5.2.6 NC 膜抗体最适包被量的确定  58
    5.2.7 特异性检测  58-59
    5.2.8 敏感性试验  59
    5.2.9 保存期试验  59
  5.3 小结  59-60
讨论  60-62
结论  62-63
参考文献  63-70
后记  70-71
攻读学位期间取得的科研成果清单  71

基于HPPRRSV N蛋白的快速免疫检测方法的建立与应用

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