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PCV2 ORF2基因真核表达质粒的构建及与猪IL-15联合免疫效果研究

作　者: 董博
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒2型 ORF2基因猪白细胞介素15
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）可以引起包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)在内的多种疾病。自从1991年在加拿大发现以来，在世界各地都陆续报道本病。目前，虽然商品化PCV2疫苗已经问世并广泛使用，但我国PCV2感染率仍呈逐年上升趋势，并已成为危害我国养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一，给养猪业带来巨大的经济损失。主要原因是目前应用的疫苗大多是针对PCV2a型病毒，而目前猪群中主要以PCV2b感染居多，而传统疫苗由于PCV2具有在细胞上繁殖条件特殊，没有明显细胞病变以及繁殖病毒滴度低等缺点，使PCV2传统疫苗生产周期长，成本高，并且免疫效果不理想。因此开发PCV2新型疫苗已成为疫苗研制的主要研究方向。由于核酸疫苗具有免疫原性好，可以诱导机体产生细胞和体液免疫，没有潜在的致病危险和毒力返祖现象，制备工艺简单，生产成本低，便于运输和贮存等优点，已经成为新型疫苗研究的热点。有报道在公猪的精液中检测出PCV2，PCV2可以通过人工受精的方式广泛传播，使得PCV2的预防更加困难。本研究针对PCV2b型病毒构建核酸疫苗，将其ORF2基因克隆到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAX1-PCV2-ORF2。将该质粒转染BHK-21细胞中，用制备的特异性PCV2多克隆抗体检测到ORF2基因可以在细胞内大量表达，为后期的动物免疫实验奠定了基础。用雄性小鼠作为动物模型，随机分成5组，分别免疫灭菌PBS(PBS组)、空载体pVAX1(空载体组)、真核表达质粒pVAX1-pIL-15(佐剂组)、真核表达质粒pVAX1-PCV2-ORF2(单独免疫组)和联合免疫pVAX1-PCV2-ORF2和pVAX1-pIL-15(联合免疫组)。在免疫过程中利用酶联免疫吸附实验和中和抗体实验，检测疫苗对小鼠体液免疫应答的影响；利用淋巴细胞增殖实验，流式细胞术和双抗体一步夹心ELISA法，检测疫苗对小鼠细胞免疫应答的影响；利用PCV2攻毒保护实验，检测疫苗对小鼠的保护效果，分别从体重变化，小鼠体内PCV2含量，各组织病理变化以及对生殖器官的影响加以评价。实验结果表明，单独免疫组小鼠各项免疫指标均高于PBS组和空载体组小鼠，联合免疫组的免疫效果更显著增强。此外，该核酸疫苗对PCV2攻击具有一定的保护作用，而且也可以保护雄性动物的生殖系统，联合免疫后保护效果更加显著。综上所述，pIL-15作为PCV2核酸疫苗的免疫分子佐剂，不但能增强机体体液和细胞免疫应答水平，还能提高小鼠抵抗PCV2感染的能力。本研究为开发安全有效的PCV2新型疫苗提供一定的理论依据和一个新方向。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-18
  1.1 猪圆环病毒感染  11-14
    1.1.1 病原  11-12
    1.1.2 流行病学  12-13
    1.1.3 临诊症状及病理变化  13-14
  1.2 PCV2 疫苗的研究进展  14-15
    1.2.1 PCV2 传统疫苗  14
    1.2.2 PCV2 新型疫苗  14-15
  1.3 IL-15 的研究进展  15-17
    1.3.1 IL-15 简介  16
    1.3.2 IL-15 对 T 细胞的影响  16
    1.3.3 IL-15 对 NK 细胞的影响  16
    1.3.4 IL-15 对 B 细胞的影响  16
    1.3.5 IL-15 在疫苗研究中的作用  16-17
  1.4 研究目的与意义  17-18
2 材料和方法  18-30
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 质粒、菌株、毒株与细胞  18
    2.1.2 实验动物  18
    2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒  18
    2.1.4 主要生化试剂  18-19
    2.1.5 主要仪器设备  19
  2.2 实验方法  19-30
    2.2.1 PCV2 ORF2 基因原核与真核表达质粒的构建  19-22
    2.2.2 重组蛋白的诱导表达以及抗原性质鉴定  22-23
    2.2.3 PCV2 多克隆抗体的制备  23-25
    2.2.4 pVAX1-PCV2-ORF2 和 pVAX1-pIL-15 体外表达检测  25
    2.2.5 质粒免疫及免疫效果检测  25-29
    2.2.6 数据处理  29-30
3 实验结果  30-45
  3.1 PCV2 多克隆抗体制备  30-34
    3.1.1 PCV2 ORF2 基因编码 Cap 蛋白的原核表达  30-31
    3.1.2 表达蛋白的纯化  31-32
    3.1.3 多克隆抗体的检测  32-34
  3.2 PCV2 ORF2 基因真核表达质粒的构建  34
  3.3 真核表达质粒 pVAX1-PCV2-ORF2 与 pVAX1-pIL-15 体外表达检测  34-35
  3.4 体液免疫应答检测  35-37
    3.4.1 PCV2 抗体检测  35-36
    3.4.2 中和抗体检测  36-37
  3.5 细胞免疫应答检测  37-40
    3.5.1 淋巴细胞增殖实验  37
    3.5.2 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群含量变化  37-39
    3.5.3 IFN-γ和 IL-4 含量变化  39-40
  3.6 疫苗保护效果检测  40-45
    3.6.1 体重变化  40-41
    3.6.2 PCV2 含量的变化  41-42
    3.6.3 病理变化  42
    3.6.4 生殖系统变化  42-45
4.讨论  45-48
  4.1 可溶性蛋白的纯化  45
  4.2 实验设计  45
    4.2.1 ORF2 基因的选择  45
    4.2.2 动物模型的选择  45
    4.2.3 攻毒剂量和攻毒方式的确定  45
  4.3 疫苗免疫效果的评价  45-47
    4.3.1 体液免疫应答  45-46
    4.3.2 细胞免疫应答  46
    4.3.3 疫苗保护效果  46-47
  4.4 与其他PCV2新型疫苗免疫效果比较  47-48
5.结论  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-61
附件  61-63
攻读硕士期间发表的学术论文  63

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