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维生素C对黏杆菌素致DRG神经元细胞毒性的颉颃作用

作　者: 孙美成
导　师: 李继昌
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 黏杆菌素外周神经毒性维生素C 背根神经细胞拮抗剂
分类号: S859.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黏杆菌素对革兰氏阴性敏感菌具有非常强大的杀灭作用，是一种治疗多重耐药性革兰氏阴性菌感染的特效药物。虽然黏杆菌素由于临床应用中表现出的肾毒性和神经毒性而被人们放弃使用数十余年，但由于近年来铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌等革兰氏阴性菌感染的加剧，且耐药性越来越强的环境下，黏杆菌素因其强大的杀菌作用和不易产生耐药性的特点，重新被人们重视起来。所以，探寻和发现能够降低或消除黏杆菌素毒性作用的药物的研究具有重要的理论和临床实践意义。作为一种抗毒性药物和抗氧化剂，维生素C被广泛应用于治疗各种药物引起的毒副作用。最新研究表明，维生素C对黏杆菌素的肾毒性具有很多好的拮抗作用，但并未有实验表明其对黏杆菌素所致的外周神经毒性具有拮抗作用。本实验利用体外细胞培养技术，以培养4d的小鼠原代背根神经节（DRG）神经元细胞作为研究对象，通过测定细胞相对活力、Caspase-3活性，以及细胞培养液中的乙酰胆碱、LDH和SOD的浓度，探讨维生素C对硫酸黏杆菌素外周神经毒性是否具有拮抗作用。经测定，硫酸黏杆菌素对DRG神经元细胞活性的半数抑制浓度(IC₅₀)为250μg·mL^-1。将250μg·mL^-1的黏杆菌素作为母液和对照组，利用母液配制不同维生素C浓度组的培养液，以维生素C终浓度为250、500、750、1000、1250μg·mL^-1的培养液作为实验组，分别加入到培养4d的小鼠DRG细胞中，37℃，5%CO2条件下培养24h后观察细胞形态学变化，同时测定细胞相对活性值、Caspase-3活性，以及利用细胞上清液测定LDH水平、乙酰胆碱含量以及SOD活性。实验结果表明：（1）当维生素C浓度达到一定量(1000μg·mL^-1)时，能够很好的拮抗黏杆菌素对背根神经形态学上的破坏。（2）维生素C可以降低细胞培养液中LDH水平，有效地减小了黏杆菌素对细胞膜的破坏。（3）维生素C实验组的细胞相对活力、Caspase-3活性、乙酰胆碱活性、LDH和SOD活性都与对照组有着显著性的差异，并且对这些指标的影响具有一定的剂量依赖性趋势。总之，从形态学角度证明了维生素C对硫酸黏杆菌素的DRG神经元细胞毒性具有拮抗作用；一定剂量的维生素C可以使由硫酸黏杆菌素导致的细胞毒性反应趋于正常，其中毒性反应包括细胞相对活力变小、Caspase-3活性变大、乙酰胆碱浓度、LDH和SOD水平异常；维生素C对黏杆菌素外周神经毒性的拮抗作用可能是由于其本身的抗氧化功能。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-21
  1.1 黏杆菌素概述  11-14
    1.1.1 黏杆菌素的理化性质  11
    1.1.2 黏杆菌素的药代动力学  11
    1.1.3 黏杆菌素抗菌机理  11-12
    1.1.4 黏杆菌素的体外抑菌活性  12
    1.1.5 黏杆菌素的耐药性  12
    1.1.6 黏杆菌素的毒理学研究  12-13
    1.1.7 黏杆菌素毒性机制  13-14
    1.1.8 黏杆菌素的临床应用进展  14
  1.2 维生素 C 概述  14-17
    1.2.1 维生素  14-15
    1.2.2 维生素 C 的理化性质  15-16
    1.2.3 维生素 C 的生理功能  16
    1.2.4 维生素 C 的应用  16-17
  1.3 背根神经  17-19
    1.3.1 神经系统  17-18
    1.3.2 神经节  18
    1.3.3 神经细胞  18-19
  1.4 神经毒性拮抗剂  19-20
    1.4.1 药物的神经毒性  19-20
    1.4.2 药物神经毒性拮抗剂  20
  1.5 课题研究的目的意义  20-21
2 材料与方法  21-27
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 仪器  21
    2.1.3 主要试剂及材料  21-22
    2.1.4 主要试剂的配制  22-23
  2.2 试验方法  23-27
    2.2.1 原代小鼠背根神经节（DRG）神经元细胞的培养  23
    2.2.2 背根神经细胞的鉴定  23
    2.2.3 黏杆菌素对背根神经细胞半数抑制率（IC50）的测定  23-24
    2.2.4 维生素 C 对黏杆菌素背根神经细胞毒性的拮抗作用  24-27
3 结果  27-35
  3.1 背根神经细胞形态结构观察  27
  3.2 背根神经细胞 NSE 免疫组化染色鉴定  27-28
  3.3 硫酸黏杆菌素对背根神经细胞半数抑制浓度(IC_(50))的测定  28
  3.4 维生素 C 对背根神经细胞形态学的保护  28-29
  3.5 MTT 法测定细胞相对活性结果  29-30
  3.6 Caspase-3 活性检测  30-31
  3.7 LDH 水平测定  31-32
  3.8 乙酰胆碱含量的测定  32-33
  3.9 SOD 活性的测定  33-35
4 讨论  35-40
  4.1 黏杆菌外周神经素毒性的研究  35
  4.2 小鼠背根神经的体外培养  35-36
  4.3 维生素 C 对背根神经细胞形态的保护作用  36-37
  4.4 维生素 C 对背根神经细胞相对活力的保护  37
  4.5 维生素 C 对黏杆菌素致背根神经细胞凋亡的拮抗作用  37-38
  4.6 维生素 C 对背根神经细胞生理活性的影响  38-39
    4.6.1 细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）水平的变化  38
    4.6.2 细胞内乙酰胆碱含量的改变  38
    4.6.3 细胞液中超氧化物歧化酶（SOD）含量的变化  38-39
  4.7 维生素 C 对黏杆菌素外周神经毒性拮抗作用  39-40
5 结论  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-51
附录  51-52
攻读硕士学位期间发表的学术论文  52

维生素C对黏杆菌素致DRG神经元细胞毒性的颉颃作用

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