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复合植物提取物的组方、安全性评价及其在小鼠上的应用研究

作　者: 孙雨晴
导　师: 徐子伟
学　校: 浙江师范大学
专　业: 动物学
关键词: 植物提取物组方安全性评价小鼠抑菌抗氧化
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物提取物因含有多种生理活性成分,在动物体内具有增强免疫、抗氧化、调节代谢等多重生理功能,且兼有无残留和无耐药性等特点,被公认为是饲用抗生素的理想替代品之一。因此本研究针对目前畜禽生产中存在的抗生素耐药性和药物残留等问题,从多种具有较强体外抑菌和抗氧化功能的植物中筛选复合植物原料,提取后加以组方,进一步通过安全性评价并初步在小鼠上进行应用研究,为其最终在畜禽健康养殖中的应用提供科学基础和依据。论文主要研究结果如下：1.复合植物原料的遴选、提取及体外抑菌和抗氧化试验遴选具有较强抑菌和抗氧化活性的艾叶、石榴皮、五味子等17种天然植物原料,利用微波辅助提取法制备上述植物原料的水提物,浓缩至含生药0.5g/ml,逐一检测各提取物的体外抑菌和抗氧化活性。抑菌试验试验结果表明,五味子(WWZ)和吴茱萸(WZY)对大肠埃希氏菌C83912、临床分离菌株链球菌和副伤寒沙门氏菌等3种菌株均有较强抑制作用,其中WWZ对上述三种菌株的抑菌率分别为100%,91%和100%,WZY对各菌株的抑制率分别为34%、14%和91%,其它植物提取物的抑菌率均较低或未检测到抑菌效果。抗氧化试验结果表明石榴皮(SLP)和艾叶(AY)具有较强的抗氧化能力,其对DPPH-自由基的半清除浓度IC50分别为1.64mg/ml和6.19mg/ml,其它各种植物提取物的IC50值均在10.10～152.54mg/ml之间。2.复合植物提取物的组方研究与功能活性成分分析根据上述结果,选取具有较好抑菌效果的WWZ和WZY及较强抗氧化功能的AY和SLP作为植物组方的原料,采用L9(43)正交组合试验设计,按上述方法分别制备9种复合植物组方的提取物并测定其体外抑菌率和IC50。根据试验结果推导出最优植物组方,即组方1(AY:SLP:WWZ:WZY=3:1:9:9)和组方2(AY:SLP: WWZ:WZY=3:9:9:9)。抑菌试验结果显示组方1对大肠埃希氏菌C83912、链球菌和副伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度MIC分别500、250、250mg/ml,组方2对三种菌株的MIC分别为250、500、500mg/ml。抗氧化试验结果表明,组方1和组方2的IC50分别为6.46mg/ml和3.63mg/ml。分别采用Folin-Ciocaileu法、苯酚-硫酸法、NaNO2-Al(NO3)3比色法、电位滴定法检测组方1和组方2提取物中总酚、总多糖、总黄酮及总有机酸的含量。各试验结果显示,组方1含总酚8.02%、总多糖1.74%、总黄酮10.38%和总有机酸9.71%；组方2相应成分含量分别为10.63%、2.16%、8.02%及7.31%。3.复合植物提取物的安全性评价参照GB15193.3-2003的要求,采用霍恩氏法并稍作修改对上述2种复合及4种单方植物提取物进行安全性评价。一次性口服试验结果表明,分别给予60、600、6000mg·kg-1·bw-1剂量的2种组方及其4种单方提取物未检测到小鼠半致死量(LD50),在最大给药量(6000mg·kg-1·bw-1)下小鼠仍未见明显中毒症状。另选取125只13-15g清洁级ICR雌性小鼠,5只口服生理盐水为对照组,其余120只随机分成6个处理,分别口服组方1、组方2、艾叶、石榴皮、五味子、吴茱萸,每个处理设111、333、1000、3000mg·kg-1·bw-14个剂量水平,试验期为14d。试验结果表明各处理组均未发现小鼠死亡及明显中毒症状,且组方1和组方2均有提高小鼠日增重和饲料转化率的趋势,其中以1000mg·kg-1·bw-1剂量组提高幅度最大。4.复合植物提取物在小鼠上的应用研究选取80只11-13g的Balb/c雌性小鼠,随机分成5组,分别为正常对照组、模型对照组、抗生素组、F1组和F2组。正常对照组小鼠每日灌服生理盐水并每4d注射一次生理盐水；模型对照组小鼠每日灌服生理盐水并每4d注射一次环磷酰胺制造小鼠免疫抑制模型,前2次环磷酰胺注射剂量分别为100mg·kg-1·bw-1,第3、4次均为50mg·kg-1·bw-1;抗生素组在模型对照基础上每日口服50mg·kg-1·bw-1剂量的金霉素代替口服生理盐水；试验F1和F2组分别在模型对照组基础上每日口服1000mg·kg-1·bw-1剂量组方1和组方2代替口服生理盐水。记录全期采食量和日增重,试验期为14d。试验结束每组随机选取8只进行屠宰,收集相关样品进行免疫指标和抗氧化功能研究。结果表明：①与正常对照组比,模型组小鼠的日增重、饲料转化率、脾脏指数、胸腺指数及肝脏过氧化氢酶(CAT)活性与总抗氧化能力(T-AOC)均显著降低(P<0.05),肝脏MDA含量显著性升高(P<0.05)；②与模型对照组比,F1组和F2组的日增重、饲料转化率及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、T-AOC活力均显著提高(P<0.05),肝脏MDA含量显著性降低(P<0.05)；F1的脾脏指数显著提高(P<0.05)。③与抗生素组相比,F1和F2的日增重、饲料转化率、SOD活性、CAT活性及T-AOC均显著提高(P<0.05),MDA含量均显著降低(P<0.05)；F1的脾脏指数显著提高(P<0.05)。每组剩余小鼠于第15d腹腔注射大肠杆菌,并继续口服相应组方,观察并记录48h内死亡率和腹泻率。结果表明,正常对照组、模型对照组、抗生素组、F1和F2组小鼠腹泻率分别为25%、66.6%、25%、25%和75%,死亡率分别为0%、33.3%、0%、0%和37.5%。综上所述,本研究通过体外抑菌和抗氧化试验,获得由艾叶、石榴皮、五味子、吴茱萸等植物原料组成的复合植物提取物组方2种,并以小鼠为受试动物对组方进行了安全性评价,初步验证其中的1种组方在小鼠上具有显著促生长、抗氧化及抗菌及免疫增强效果。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
目录  11-14
符号说明  14-15
第一章文献综述  15-23
  1 天然植物活性成分的生理功能  15-16
  2 天然植物活性成分的提取工艺  16-18
    2.1 传统浸提技术  16
    2.2 超声提取技术  16
    2.3 微波辅助提取技术  16-17
    2.4 生物酶解提取技术  17
    2.5 超临界流体萃取技术  17
    2.6 半仿生提取技术  17
    2.7 联合提取技术  17-18
  3 植物提取物在动物生产中的应用  18-19
    3.1 在单胃动物的应用  18
    3.2 在家禽的应用  18-19
    3.3 在反刍动物的应用  19
  4 植物提取物改善动物健康的机理  19-22
    4.1 增强肠道上皮防御功能  19-20
    4.2 调节肠道微生态结构  20
    4.3 调节机体免疫  20-21
    4.4 抗氧化功能  21
    4.5 其它  21-22
  5 本论文提出与意义  22-23
第二章复合植物原料的遴选、提取及体外抑菌和抗氧化试验  23-29
  1 试验材料与方法  23-25
    1.1 主要仪器与设备  23
    1.2 主要试剂与菌种  23
    1.3 植物原料与提取物制备  23-24
    1.4 培养基制备与菌种活化  24
    1.5 测定指标与方法  24-25
  2 试验结果  25-26
  3 讨论  26-28
    3.1 天然植物体外抑菌活性的分析  26-27
    3.2 植物提取物的体外抗氧化活性分析  27-28
  4 小结  28-29
第三章复合植物提取物的组方研究与功能活性成分分析  29-37
  1 材料与方法  29-32
    1.1 主要仪器与设备  29
    1.2 主要试剂与菌种  29-30
    1.3 试验设计与提取物制备  30
    1.4 培养基制备与菌种活化  30
    1.5 测定指标与方法  30-32
  2 试验结果  32-34
    2.1 不同组合提取物抑菌率与IC_(50)的比较  32-33
    2.2 优势组合的推导  33-34
    2.3 两种组方提取物的化合物含量、MIC及IC_(50)  34
  3 讨论  34-36
  4 小结  36-37
第四章复合植物提取物的安全性评价  37-45
  1 试验材料与方法  37-38
    1.1 主要仪器与试剂  37
    1.2 试验动物及其饲养管理  37
    1.3 试验设计与方法  37-38
    1.4 数据处理与统计分析  38
  2 试验结果  38-42
    2.1 对小鼠的急性毒性评价  38
    2.2 对小鼠体重及采食的影响  38-39
    2.3 对小鼠脏器指数的影响  39-40
    2.4 对小鼠血液常规指标的影响  40-42
  3 讨论  42-44
    3.1 植物提取物的毒性评价  42
    3.2 植物提取物对小鼠采食、消化及生长性能的影响  42-43
    3.3 植物提取物对小鼠血液常规指标的影响  43-44
  4 小结  44-45
第五章复合植物提取物在小鼠上的应用研究  45-55
  1 试验材料与方法  45-47
    1.1 主要仪器与设备  45
    1.2 主要试剂、试剂盒及菌种  45
    1.3 试验动物与饲养管理  45
    1.4 试验设计、处理流程与样品采集  45-46
    1.5 大肠杆菌的活化与培养  46
    1.6 测定指标与方法  46-47
    1.7 数据处理与统计分析  47
  2 试验结果  47-50
    2.1 小鼠生长情况及免疫器官指数  47-48
    2.2 小鼠肝脏抗氧化功能  48-49
    2.3 大肠杆菌攻毒后小鼠的腹泻与死亡情况  49-50
  3 讨论  50-53
    3.1 免疫抑制动物模型的建立与环磷酰胺的作用  50
    3.2 植物活性成分对免疫抑制动物生长性能的调控作用  50-51
    3.3 植物活性成分对免疫抑制动物免疫机能改善作用  51-52
    3.4 植物活性成分对免疫抑制动物氧化还原状态的调控作用  52-53
    3.5 植物活性成分对免疫抑制动物抗大肠杆菌侵染能力的影响  53
  4 小结  53-55
全文结论  55-56
参考文献  56-67
攻读学位期间发表的学术论文  67-68
致谢  68-69

复合植物提取物的组方、安全性评价及其在小鼠上的应用研究

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