学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鸡SelW过表达CHO-K1细胞系的构建及其抗氧化功能的研究

作　者: 韩艳辉
导　师: 徐世文
学　校: 东北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸡SelW CHO-K1 过表达 抗氧化 过氧化氢
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 38次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


硒是生物体生命活动的必需微量元素,其主要以硒蛋白的形式发挥生物学作用。硒蛋白W (SelW)是硒蛋白家族的一员,在多种动物的不同组织中均可表达,并且哺乳动物SelW可以作为一种氧化还原酶。目前关于SelW的研究主要集中于哺乳类动物,如灵长类和啮齿类。禽类SelW除组织分布研究的较清楚外,其它知之甚少,尤其是鸡SelW的体外表达方面的研究还未见报道,鸡SelW的生物学作用也研究较少。本研究根据分子生物学技术构建包含3‘UTR区域SECIS在内的鸡SelW真核细胞表达载体和绿色荧光蛋白重组表达载体。通过绿色荧光蛋白重组表达载体对细胞转染条件进行了优化,将鸡SelW真核表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞中,采用RT-PCR和实时荧光定量PCR (qPCR)技术对转染后的细胞SelW表达情况进行了检测,同时还采用qPCR技术检测了硒蛋白合成相关酶硒代半胱氨酸合成酶(SecS)和硒磷酸化物合成酶(SPS-1) mRNA水平。随后以鸡SelW过表达CHO-K1细胞系和CHO-K1正常细胞为试验对象,采用AO/EB双染和TUNEL方法对不同浓度的过氧化氢诱导的细胞凋亡情况进行检测,同时采用qPCR方法测定过表达细胞系和正常细胞系中Caspase-3、Caspase-8和FasmRNA水平,结果表明：1根据已知鸡SelW cDNA序列,我们设计了能够克隆出鸡SelW SECIS的引物,并成功构建了鸡SelW真核细胞表达载体pcDNA3.1/SelW。2通过限制性内切酶和DNA连接酶,我们成功将pEGFP-N1中的绿色荧光光蛋白基因连接到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)上,构建了重组绿色荧光蛋白表达载体pcDNA3.1/GFP。优化转染试验中,转染试剂和pcDNA3.1/GFP的比例为8:2(μL:ng)时转染效率最高。3本实验成功将鸡SelW转染到CHO-K1细胞中,最适条件是六孔板每孔加入8μL转染试剂和2μg的表达载体。pcDNA3.1/SelW转染24h和48h后,对转染pcDNA3.1/SelW的细胞和未转染pcDNA3.1/SelW的细胞中SelW、SecS和SPS-1mRNA水平进行检测,经琼脂糖凝胶电泳图像显示,转染pcDNA3.1/SelW的细胞中出现了SelW特异性条带,而未转染pcDNA3.1/SelW细胞中没有此条带的出现,同时qPCR显示,转染鸡SelW细胞中的SelW mRNA水平明显高于未转染细胞,说明我们成功构建了鸡SelW过表达细胞系。我们还发现转染鸡SelW细胞的SecS mRNA水平明显增高,SPS-1mRNA水平无明显变化,我们推测SecS参与了鸡SelW的合成,而SPS-1没有。4过氧化氢能够诱导鸡SelW过表达细胞系和正常细胞发生细胞凋亡。经AO/EB双染和TUNEL法检测我们发现,转染鸡SelW细胞的细胞凋亡率明显低于同水平的过氧化氢诱导的未转染细胞,同时对细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平检测发现,经同浓度过氧化氢诱导的转染鸡SelW的细胞中,Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平明显低于未转染细胞,提示鸡SelW能够降低过氧化氢诱导的细胞损伤,在抵御氧化应激中发挥重要作用,具有抗氧化的作用。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-19
  1.1 硒与硒蛋白  11-12
  1.2 硒蛋白  12-15
    1.2.1 硒蛋白的合成与调控  12-14
    1.2.2 硒蛋白合成相关因子  14-15
  1.3 SelW  15-18
    1.3.1 SelW的组织分布  15-16
    1.3.2 硒对SelW的调控  16-17
    1.3.3 SelW的氧化还原功能  17-18
  1.4 试验的目的与意义  18-19
2 材料与方法  19-29
  2.1 实验材料  19-21
    2.1.1 仪器设备  19
    2.1.2 菌种、载体与细胞系  19-20
    2.1.3 实验试剂  20
    2.1.4 主要试剂的配制  20-21
  2.2 实验方法  21-29
    2.2.1 鸡SelW基因的克隆和真核表达载体的构建  21-23
    2.2.2 绿色荧光蛋白表达载体构建  23-24
    2.2.3 细胞转染前准备  24-25
    2.2.4 鸡SelW基因细胞转染和细胞处理  25
    2.2.5 鸡SelW基因细胞转染后处理  25
    2.2.6 过氧化氢诱导细胞凋亡的TUNEL检测法  25-26
    2.2.7 过氧化氢诱导细胞凋亡的AO/EB双染检测法  26
    2.2.8 鸡SelW基因的RT-PCR检测  26-27
    2.2.9 实时定量PCR法检测细胞SelW、SecS、SPS-1基因以及凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA表达的检测  27-28
    2.2.10 试验数据的统计及分析  28-29
3 结果与分析  29-45
  3.1 鸡SelW基因真核表达载体构建  29-31
    3.1.1 鸡SelW cDNA基因克隆  29
    3.1.2 鸡SelW序列测序鉴定及分析  29-30
    3.1.3 鸡SelW cDNA真核表达载体构建  30-31
  3.2 绿色荧光蛋白表达载体构建  31-33
  3.3 CHO-K1细胞增值生长曲线  33
  3.4 CHO-K1过氧化氢LD_(50)的测定和形态学观察  33-34
  3.5 细胞转染条件的优化  34-35
  3.6 过氧化氢诱导细胞凋亡的TUNEL法检测结果  35-38
  3.7 过氧化氢诱导细胞凋亡的AO/EB双染检测结果  38-39
  3.8 SelW、SecS、SPS-1、Caspase-3、Caspase-8和Fas基因实时定量PCR检测方法的建立  39-40
  3.9 细胞转染鸡SelW基因后SelW的RT-PCR检测结果  40-42
  3.10 细胞转染鸡SelW基因后SelW、SecS、SPS-1基因mRNA表达的检测  42-44
    3.10.1 细胞转染鸡SelW基因后SelW mRNA表达的检测结果  42
    3.10.2 细胞转染鸡SelW基因后SecS mRNA表达的检测结果  42-43
    3.10.3 细胞转染鸡SelW基因后SPS-1 mRNA表达的检测结果  43-44
  3.11 细胞转染鸡SelW基因后凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA表达的检测结果  44-45
4 讨论  45-50
  4.1 鸡SelW真核表达载体的构建和细胞系的选择  45-46
  4.2 细胞转染条件的优化  46-47
  4.3 细胞转染后SelW、SecS和SPS-1基因的表达量变化  47
  4.4 鸡SelW的抗氧化分析  47-50
5 结论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-63
附图  63-66
攻读硕士学位期间发表的论文  66

相似论文

  1. 白骨壤果实中黄酮类化合物的提取、分离纯化及抗氧化活性研究,S793.9
  2. 翡翠贻贝糖胺聚糖降血脂作用的研究,R285.5
  3. 调和玉米油对肉仔鸡抗氧化应激、脂质代谢酶及免疫基因表达的影响,S831.5
  4. 基于目标成分“敲出/敲入”质量控制模式的中药姜黄抗氧化药效物质辨识,R285
  5. 藏药三果汤散抗氧化有效成分研究,R29
  6. 酢浆草提取物体外抗肿瘤和抗氧化研究,R285
  7. ABA和H2O2对干旱高温复合胁迫诱导的玉米sHSPs和抗氧化防护酶的作用,S513
  8. “和美酵素”在断奶仔猪生产中的应用研究,S828.9
  9. 固体氧化物燃料电池铁素体连接体材料的性能研究,TM911.4
  10. 芝麻饼粕中木酚素的提取及抗氧化活性研究,TS229
  11. 条斑紫菜（Porphyra yezoensis）R-藻红蛋白的生物修饰及活性保护研究,TS201.21
  12. 脂肪酶催化猪油合成Vc脂肪酸酯及其抗氧化活性的研究,TS202.3
  13. 麦胚多糖提取、纯化及抗氧化活性研究,TS210.1
  14. 山药蛋白质分离纯化及抗氧化活性研究,TS255.1
  15. 控释复合肥对烤烟生理特性、生长发育及品质的影响,S572
  16. 云南十种辣椒抗氧化及抑菌活性的研究,S641.3
  17. 金针菇水溶性物质与不溶性残渣的制备及理化性质研究,S646.15
  18. 5-氨基乙酰丙酸调节梨树叶片光合特性的研究,S661.2
  19. 菊花花器官耐热性研究及外源NO对菊花耐热性的影响,S682.11
  20. 外源H2O2和AsA对大蒜试管苗玻璃化及内源活性氧代谢特征的影响,S633.4
  21. 植物精油对草莓和杨梅果实保鲜的作用及机理研究,S667.6

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
© 2012 www.xueweilunwen.com