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中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度相关候选基因的筛选及其关联性分析

作　者: 田月珍
导　师: 黄锡霞; 田可川
学　校: 新疆农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 中国美利奴羊(新疆型) 羊毛细度 候选基因 RT-PCR 关联性
分类号: S826.81
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


羊毛细度是决定羊毛价格的关键性因素,皮肤毛囊是羊毛生长的基础,对其发生和发育的研究是重点领域之一。寻找影响羊毛生长的闪素、探明主效基因的调控机理,筛选出可以用来标记绵羊产毛性能的分子标记,从而为进一步开展分子育种工作奠定基础。本研究是在课题组成员利用表达谱芯片检测细毛羊纤维直径相关候选基因的基础上,建立了适于定量检测绵羊皮肤组织中nRNA表达的实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测了14个候选基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的mRNA表达差异,从基因水平探讨了候选基因的表达变化及其与羊毛细度之间的内在联系,并检测了TXNIP.KRT26基因的SNP位点,分析了该基因与羊毛细度的关联性。本研究获得的主要成果如下：1.绵羊皮肤组织中内参基因的筛选：本实验利用RT-PCR技术,从GeneBank中查找绵羊的6个候选内参基因,获得相应的扩增片段,分别为18SrRNA:185bp、β-Actin:225bp.GAPDH:181bp、B2M：138bp、TBP：186bp、RPL13A：81bp。采用geNorm软件筛选最适合绵羊皮肤组织的内参基因。筛选结果为：内参基因的最适数目为3个,将B2M、RPL13A、TBP、18S rRNA.ACTB/GAPDH内参基因的表达稳定度的平均M值依次为：0.536>0.480>0.476>0.472>0.371,表达稳定度由低到高：最终确定了在绵羊皮肤组织中以18SrRNA.β-Actin和GAPDH三个看家基因作为内参基因最理想,并据此建立了基于SYBR Green染料技术适于绵羊皮肤组织中mRNA表达定量检测的RT-PCR方法,即实时荧光定量PCR。2.实时荧光定量PCR法筛选羊毛细度相关的候选基因：本实验采用实验一建立的RT-PCR方法检测了TXNIP、KRT26、PIK3CA、PPARD、FZD3、TFDP1、PTPN13、RPS6KA、ABCG2、ADAM9、GJB3、GSTA1、FAIM、LAMB1等14个基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的相对表达。检测结果表明：14个候选基因在绵羊的皮肤组织中均有表达,与细型细毛羊相比,超细型细毛羊皮肤组织中表达上调的基因是KRT26、TXNIP、TFDP1、FAIM;而表达下调的基因是PIK3CA.ADAM9.FZD3,即羊毛细度越细,其皮肤组织中KRT26等上调基因的表达量越高,反之亦然。3.TXNIP和KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性分析：本实验首次采用PCR.SSCP技术检测TXNIP和KRT26两个候选基因在中国美利奴羊(新疆型)群体中的SNP位点,分析该基因遗传多态性和其与羊毛细度的相关性。结果表明：TXNlP和KRT26基因均有AA、AB、BB三种基因型；TXNIP基因检测到2处突变,即52bp-/T,86bpG/T均为同义突变,其与羊毛细度差异不显著(P>0.05)；KRT26基因出现5处碱基的突变,分别为83bp(G/C),86bp(T/C),112bp(C/T),140bp(G/A),247bp(C/T),前3处为同义突变,后2处发生了氨基酸的替代,即Val/Ile,Asn/Lys,其3种基因型个体之间的羊毛细度差异极显著(P<0.01),因此,KRT26基因可以作为绵羊毛细度相关候选基因。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 绪论  9-26
  1.1 绵羊羊毛生产及市场基本情况  9-10
  1.2 毛囊发生的分子机理  10-13
    1.2.1 毛囊发生及羊毛生长  10-11
    1.2.2 毛囊发生的分子机理  11-13
  1.3 羊毛纤维结构及其组成  13-14
    1.3.1 羊毛纤维结构  13-14
    1.3.2 羊毛纤维组成  14
  1.4 毛囊角蛋白基因表达及调控  14-17
    1.4.1 毛囊角蛋白分类  14-15
    1.4.2 中间丝(IF)角蛋白  15
    1.4.3 角蛋白关联蛋白(中间丝关联蛋白IKAPs)  15
    1.4.4 角蛋白基因在毛囊中的表达  15-16
    1.4.5 角蛋白基因的表达调控  16-17
  1.5 国内外毛性状分子生物学研究进展  17-19
    1.5.1 羊毛主要经济性状QTL  17-18
    1.5.2 羊毛性状的微卫星标记研究进展  18-19
  1.6 与毛囊发育相关的差异表达基因  19-21
  1.7 利用荧光定量PCR技术研究候选基因的表达  21-23
    1.7.1 RT-PCR技术原理  21
    1.7.2 荧光化学  21-22
    1.7.3 定量方法  22-23
    1.7.4 实时荧光定量PCR技术应用于基因表达的定量分析  23
  1.8 利用PCR-SSCP技术研究候选基因的多态性及其与性状的关联性  23-25
    1.8.1 基本原理  23-24
    1.8.2 在绵羊分子育种方面的应用  24-25
  1.9 本研究的意义  25-26
第二章 绵羊皮肤组织中内参基因的筛选  26-41
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 实验羊来源及样品采集  27
    2.1.2 主要仪器设备  27-28
    2.1.3 试剂盒及普通试剂  28
    2.1.4 溶液与缓冲液的配制  28
  2.2 实验方法  28-31
    2.2.1 内参基因引物设计  28-29
    2.2.2 绵羊皮肤组织中RNA提取及其检测  29
    2.2.3 反转录合成cDNA第一条链  29-30
    2.2.4 荧光定量PCR体系的建立及产物检测  30
    2.2.5 标准曲线的绘制  30-31
    2.2.6 统计分析  31
  2.3 结果  31-37
    2.3.1 皮肤组织中总RNA的提取结果  31-32
    2.3.2 标准曲线绘制结果  32-34
    2.3.3 融解曲线分析结果  34
    2.3.4 绵羊皮肤组织中内参基因的表达水平  34-35
    2.3.5 绵羊皮肤组织中最适内参基因的筛选  35-37
  2.4 讨论  37-41
    2.4.1 实时荧光定量PCR技术  37
    2.4.2 转录表达中的内参基因的选择  37-40
    2.4.3 绵羊皮肤组织中内参基因的选择  40-41
第三章 实时荧光定量PCR法筛选羊毛细度相关的候选基因  41-52
  3.1 实验材料  42
    3.1.1 实验羊来源及样品采集  42
    3.1.2 主要仪器设备  42
    3.1.3 试剂盒及普通试剂  42
    3.1.4 缓冲液与溶液的配制  42
  3.2 实验方法  42-44
    3.2.1 候选基因引物设计  42-43
    3.2.2 绵羊皮肤组织中RNA提取及其检测  43
    3.2.3 反转录合成cDNA第一条链  43
    3.2.4 荧光定量PCR体系的建立及产物检测  43-44
    3.2.5 标准曲线的绘制  44
    3.2.6 统计分析  44
  3.3 结果  44-47
    3.3.1 PCR扩增产物检测  44-45
    3.3.2 标准曲线及熔解曲线结果分析  45-46
    3.3.3 不同细度绵羊皮肤组织中候选基因的表达  46-47
  3.4 讨论  47-52
    3.4.1 RT-PCR法筛选与羊毛细度相关候选基因  47-48
    3.4.2 差异表达基因分析  48-52
第四章 TXNIP和KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性分析  52-67
  4.1 实验材料  53-54
    4.1.1 实验羊来源及样品采集  53
    4.1.2 主要仪器设备  53
    4.1.3 试剂盒及普通试剂  53-54
    4.1.4 凝胶电泳所用试剂的配制  54
  4.2 实验方法  54-59
    4.2.1 SNP筛选引物设计  54-55
    4.2.2 基因组DNA的提取及其检测  55-56
    4.2.3 PCR反应体系的建立及扩增程序  56
    4.2.4 12%变性聚丙稀酷胺凝胶电泳  56-57
    4.2.5 银染及显色  57-58
    4.2.6 PCR产物测序  58
    4.2.7 统计分析  58-59
  4.3 结果  59-63
    4.3.1 血样中DNA的提取结果  59
    4.3.2 PCR-SSCP凝胶电泳结果  59-60
    4.3.3 TXNIP基因的SNP位点筛查  60-61
    4.3.4 KRT26基因的SNP位点筛查  61-62
    4.3.5 候选基因的基因型和等位基因频率  62-63
    4.3.6 候选基因的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数  63
    4.3.7 候选基因与羊毛细度的相关性分析  63
  4.4 讨论  63-67
    4.4.1 TXNIP基因群体遗传结构分析  64
    4.4.2 TXNIP基因与羊毛细度关联分析  64-65
    4.4.3 KRT26基因群体遗传结构分析  65
    4.4.4 KRT26基因与羊毛细度关联分析  65-67
第五章 结论  67-68
参考文献  68-75
致谢  75-76
作者简介  76

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