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油茶组培体系的建立及VIGS系统在油茶、油桐基因功能研究中的应用

作　者: 刘虹
导　师: 罗克明
学　校: 西南大学
专　业: 植物学
关键词: 油茶组织培养油桐 PDS基因病毒诱导的基因沉默
分类号: S794.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

油茶(Camellia oleifera)为山茶科山茶属植物,是我国特有的油料作物。油茶籽中茶油的含量很高,而茶油中所含的不饱和脂肪酸等具有降低血清胆固醇、抗癌、抗氧化等多种生物活性,因此,茶油具有极高的营养价值。油茶在我国的分布范围较广,近年来,随着国家大力发展油茶产业,栽培规模进一步扩大,但是,总体上油茶种植存在经营粗放,产量低,且产量相差悬殊、极不稳定等问题。目前,国内主要采用油茶优良无性系造林,虽然该方法在一定程度上提高了茶油的产量和品质,但是仍远不能满足速生丰产油茶育苗的需求。因此,非常有必要开展油茶优良品种的组织快繁研究,该技术的成功可以有效解决油茶的快速繁育问题,具有重大的生产和科研价值。此外,现有的油茶品种的产量及品质均不高,导致人们种植的积极性不够,因此,对油茶品种进行分子改良,尤其是提高含油量,就显得十分紧迫。但是,由于油茶的组织再生和遗传转化研究非常困难,目前尚无成功报道,本研究拟将病毒诱导的基因沉默技术—VIGS用到油茶、油桐等油料作物中,希望建立一种快速鉴定基因功能的方法,为以后研究油茶基因功能奠定良好的基础。主要结果如下：1、油茶离体培养体系的建立以油茶1月生实生苗的茎段和叶片为材料,分别采用MS和WPM为基本培养基,附加不同浓度的2,4-D和KT,诱导愈伤组织,发现各种处理组合均能不同程度地诱导出愈伤组织,其最佳诱导处理组合为：MS+2,4-D(2mg/L)+KT(1mg/L)。2、油茶组培快繁体系的建立本研究采用油茶1月生实生苗带腋芽的茎段为材料,经初代培养—继代增殖培养—生根培养后获得了完整植株,其中初代培养基中最优激素组合为：6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L,其诱导率高达98%；继代增殖培养基中最优激素组合为：6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L,增殖系数达到6.5,且丛生芽的生长状况良好。再生植株生根采用瓶内生根和瓶外生根方法,结果发现,瓶内生根的方式其生根率较低,根系脆弱,导致移栽成活率也较低。而在瓶外生根方法中,采用100mg/L IBA浸泡幼苗60min和100mg/LNAA浸泡幼苗45min其生根率为分别为75.6%±0.08和80%±0.039,且根系粗壮,移栽成活率高。3、油茶、油桐PDS基因序列的克隆及VIGS病毒载体的构建通过RT-PCR方法获得油茶、油桐番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,测序验证发现油茶、油桐PDS基因序列的相似性达到85%。双酶切PDS基因片段和烟草脆裂病毒载体(TRV2),构建为重组载体TRV2-PDS,然后将病毒载体转入农杆菌GV3101,获得GV3101-TRV2-CoPDS和GV3101-TRV2-VfPDS农杆菌。4、VIGS系统在油茶和油桐中的应用通过注射的方式将带有TRV2-CoPDS的农杆菌菌液导入油茶叶片中,三周后在油茶叶片中未观察到表型发生变化,但采用相同的方式,在被侵染的油桐植株新生叶片中发现了光漂白现象,五周后该现象进一步明显；而后将GV3101-TRV2-VfPDS导入油桐叶片中,沉默现象更为显著。提取被感染植株的总RNA,采用RT-PCR方法对病毒蛋白基因及PDS基因的表达水平进行分子检测,结果发现,在油桐中病毒蛋白基因的mRNA在植物体内大量积累,而PDS基因的表达水平显著下降,表明TRV病毒成功侵入油桐植株中,并在体内转移和复制。但在油茶中,未检测到病毒蛋白基因的表达,且PDS基因的表达水平变化不明显,表明烟草TRV病毒构建的VIGS系统在油茶中不能起作用,但可将油茶的未知功能基因通过该系统导入油桐中进行分子验证,我们的工作也为下一步大规模验证油桐基因功能奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
第1章文献综述  11-21
  1.1 油茶研究进展  11-13
    1.1.1 油茶形态及其生物学特性  11-12
    1.1.2 化学成分及其生物活性  12
    1.1.3 繁殖与栽培管理  12-13
  1.2 油茶生物技术领域研究进展  13-15
    1.2.1 油茶组织培养研究进展  13-14
    1.2.2 分子标记技术的运用  14-15
    1.2.3 cDNA文库构建以及基因克隆  15
  1.3 病毒诱导的基因沉默研究概况  15-21
    1.3.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS)的发现  15-16
    1.3.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)的作用机理  16-17
    1.3.3 病毒诱导基因沉默的病毒载体  17-18
    1.3.4 VIGS技术的优越性和局限性  18-19
    1.3.5 VIGS技术在植物基因功能上的研究和应用  19-21
第2章引言  21-23
  2.1 研究的目的与意义  21-22
  2.2 研究的技术路线  22
  2.3 研究内容  22-23
第3章油茶离体培养体系的建立  23-29
  3.1 实验材料  23
    3.1.1 植物材料  23
    3.1.2 仪器设备与试剂  23
  3.2 实验方法  23-24
    3.2.1 种子萌发试验  23
    3.2.2 茎段、叶片愈伤组织的诱导试验  23-24
  3.3 结果与分析  24-26
    3.3.1 油茶种子萌发试验  24
    3.3.2 基本培养基和激素组合对茎段愈伤组织诱导的影响  24-25
    3.3.3 基本培养基和激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响  25-26
  3.4 结论与讨论  26-29
第4章油茶组培快繁体系的建立  29-37
  4.1 实验材料  29
    4.1.1 植物材料  29
    4.1.2 主要仪器设备与试剂  29
  4.2 实验方法  29-30
    4.2.1 初代培养  29
    4.2.2 继代增殖培养  29-30
    4.2.3 壮苗培养  30
    4.2.4 生根培养  30
    4.2.5 炼苗与移栽  30
  4.3 结果与分析  30-35
    4.3.1 不同激素浓度配比对油茶茎段诱导的影响  30-31
    4.3.2 不同激素组合对油茶茎段增殖的影响  31-33
    4.3.3 不同激素浓度对油茶瓶内生根的影响  33-34
    4.3.4 不同激素浓度处理对油茶组培苗瓶外生根的影响  34
    4.3.5 不同浸蘸时间对油茶组培苗瓶外生根的影响  34-35
  4.4 结论与讨论  35-37
第5章油茶PDS基因的克隆及VIGS系统在油茶、油桐叶片中的应用  37-59
  5.1 实验材料  37-39
    5.1.1 植物材料与生长条件  37
    5.1.2 质粒与菌种  37
    5.1.3 实验仪器与试剂  37-39
  5.2 实验方法  39-46
    5.2.1 病毒载体的构建  39-44
    5.2.2 农杆菌介导的病毒感染  44
    5.2.3 侵染植株总RNA的提取  44
    5.2.4 PDS基因沉默的病毒分子检测  44-45
    5.2.5 PDS基因表达水平的分子检测  45-46
  5.3 结果与分析  46-56
    5.3.1 油茶、油桐总RNA的提取与质量检测  46
    5.3.2 油茶、油桐PDS基因序列的克隆及VIGS病毒载体的构建  46-51
    5.3.3 VIGS系统在油茶中的应用及表型观察  51-52
    5.3.4 VIGS系统在油桐中的应用及表型观察  52-53
    5.3.5 侵染植株、对照植株叶片总RNA的提取  53-54
    5.3.6 RT-PCR检测油桐、油茶PDS基因沉默的病毒分子  54-55
    5.3.7 半定量RT-PCR检测PDS基因的表达水平  55-56
  5.4 结论与讨论  56-59
参考文献  59-67
附录  67-69
致谢  69-71
在学期间所发表论文  71

油茶组培体系的建立及VIGS系统在油茶、油桐基因功能研究中的应用

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