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AtLEAFY诱导表达对菊花花期调控的研究

作　者: 王一娟
导　师: 裴雁曦
学　校: 山西大学
专　业: 植物学
关键词: 菊花农杆菌介导花期控制 NaCl胁迫诱导
分类号: S682.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

菊花(Dendranthema morifolium)为菊科多年生草本植物,是我国十大传统名花之一,同时也是太原、开封、芜湖等城市的市花。根据菊花花期的早晚可以将其划分为夏菊和秋冬菊。夏菊的花期一般在夏季,但其品种较为单一,且花型较小,观赏性较差,多被应用于街道美化。更多的菊花属于严格的短日照植物,在晚秋或者冬季开花。这样使得观赏性较强的菊花花期受到了季节的限制,导致其商品性降低。常规控制花期调控的方法已有较多研究,如对园艺栽培技术、光照时间以及温度的调控。但是这些方法大多数操作繁琐,条件不易控制,提高了花卉的成本。本研究主要目标是：利用农杆菌介导的叶盘转化法,以大菊品种黄金虎(Dendranthema morifolium (Ramat) Kitamura)的野生型及实验室已有的转基因菊花植株Y4(由rd29A：：SOC1植物表达载体转化野生型黄金虎获得)为植物材料,分别导入由rd29A启动子调控表达的具有控制植物开花时间功能的LEAFY基因,旨在获得通过简单易控的方法调控花期的菊花新种质。主要实验结果如下：1.植物表达载体的构建：从拟南芥]mRNA扩增获得的花分生组织特征基因LEAFY。使用改造的pCambia2300表达载体(已含有胁迫诱导启动子rd29A),使用酶切、连接等方法将LEAFY基因连接到rd29A启动子的下游。使用酶切和PCR检测技术,鉴定重组质粒,并转化土壤农杆菌LBA4404。2.转基因植株的获得：使用叶盘法转化菊花品种黄金虎野生型和Y4株系,分别获得54和49个抗性芽,在无选择压的培养基中培养获得相同数目的再生苗；对再生苗进行生根抗性筛选,分别获得23和45个生根抗性苗；采用PCR技术检测生根抗性苗,最终获得3和4个阳性苗,分别命名为L1、L2和L3(以野生型为遗传背景)以及SL1、SL2、SL3和SL4(以Y4为遗传背景)。转化率为2.02%和3.73%。3.NaCl胁迫诱导实验：分别选用四种不同浓度(50、100、150和200mmol/L)的NaCl溶液胁迫诱导处理L1和SL2转基因株系6h。实验结果表明：L1和SL2分别在150mmol/L和100mmol/L的NaCl溶液处理下,LEAFY基因的表达水平达到最高值。且这两个浓度对于菊花的正常生长没有明显的影响,因此确定这两个浓度为最适胁迫诱导浓度。

全文目录

中文摘要  13-14
ABSTRACT  14-16
第一章引言  16-26
  1.1 菊花花期调控技术研究现状  16-18
    1.1.1 园艺栽培技术调控  16
    1.1.2 温度调控  16
    1.1.3 光照调控  16-17
    1.1.4 植物生长调节剂调控  17-18
    1.1.5 基因工程育种调控  18
  1.2 植物基因工程常用启动子的研究现状  18-21
    1.2.1 组成型启动子  19
    1.2.2 植物组织特异性启动子  19
    1.2.3 胁迫诱导型启动子  19-20
    1.2.4 rd29A启动子  20-21
  1.3 LEAFY基因研究进展  21-24
    1.3.1 LFY基因的结构  22
    1.3.2 LFY基因的功能  22-23
    1.3.3 LFY基因的表达  23
    1.3.4 与LFY基因相关的基因调控网络  23-24
  1.4 本课题研究的目的意义和研究内容  24-26
第二章植物表达载体PV006的构建  26-34
  2.1 材料和方法  26-31
    2.1.1 材料  26-27
      2.1.1.1 菌种与质粒  26
      2.1.1.2 试剂及主要仪器设备  26
      2.1.1.3 细菌培养基  26-27
    2.1.2 方法  27-31
      2.1.2.1 植物花蕾总RNA的提取  27
      2.1.2.2 反转录  27
      2.1.2.3 PCR扩增LFY  27-28
      2.1.2.4 质粒DNA的提取  28
      2.1.2.5 酶切反应  28-29
      2.1.2.6 割胶回收及DNA纯化  29
      2.1.2.7 连接反应  29
      2.1.2.8 大肠杆菌感受态制备及转化  29-30
      2.1.2.9 重组质粒的鉴定  30-31
  2.2 结果与讨论  31-34
    2.2.1 拟南芥的花蕾RNA的提取  31
    2.2.2 PCR扩增LFY基因  31
    2.2.3 LFY基因与PV001的酶切和连接  31-33
    2.2.4 根癌农杆菌LBA4404的转化  33-34
第三章菊花转基因植株的获得  34-38
  3.1 材料与方法  34-35
    3.1.1 材料  34
      3.1.1.1 植物材料  34
      3.1.1.2 植物表达载体及菌株  34
      3.1.1.3 植物材料培养基  34
    3.1.2 方法  34-35
      3.1.2.1 野生型无菌植物材料的获得  34
      3.1.2.2 农杆菌介导的遗传转化  34-35
      3.1.2.3 分化率与生根率的计算  35
  3.2 结果  35-36
    3.2.1 野生型植株的转化  35
      3.2.1.1 抗性芽的获得  35
      3.2.1.2 生根筛选  35
    3.2.2 转基因植株Y4的转化  35-36
      3.2.2.1 抗性芽的获得  35
      3.2.2.2 生根筛选  35-36
  3.3 讨论  36-38
第四章转基因植株的检测及移栽  38-43
  4.1 材料与方法  38-39
    4.1.1 材料  38
      4.1.1.1 植物材料  38
      4.1.1.2 试剂  38
      4.1.1.3 主要仪器和设备  38
    4.1.2 方法  38-39
      4.1.2.1 菊花基因组DNA的提取  38
      4.1.2.2 PCR检测  38
      4.1.2.3 组培苗的炼苗和移栽  38-39
      4.1.2.4 转化率的计算公式  39
  4.2 结果与分析  39-41
    4.2.1 野生型遗传背景的转基因阳性苗的获得  39-40
      4.2.1.1 DNA的提取  39
      4.2.1.2 生根抗性苗的PCR检测  39-40
    4.2.2 以Y4为遗传背景的转基因阳性苗的获得  40-41
      4.2.2.1 DNA的提取  40
      4.2.2.2 生根抗性苗的PCR检测  40-41
    4.2.3 组培苗的炼苗和移栽  41
  4.3 讨论  41-43
第五章 NaCl胁迫处理转基因植株的研究  43-49
  5.1 材料和方法  43-44
    5.1.1 材料  43
      5.1.1.1 植物材料  43
      5.1.1.2 试剂及药品  43
      5.1.1.3 主要仪器及设备  43
    5.1.2 方法  43-44
      5.1.2.1 NaCl胁迫诱导浓度范围的确定  43
      5.1.2.2 最佳NaCl胁迫诱导浓度的确定  43
      5.1.2.3 处理后RNA的提取和反转录  43-44
      5.1.2.4 半定量RT-PCR检测LFY基因的表达变化  44
  5.2 结果  44-47
    5.2.1 NaCl胁迫诱导浓度范围的确定  44-45
    5.2.2 最佳NaCl胁迫诱导浓度的确定  45-47
      5.2.2.1 转基因株系L1最佳浓度的确定  45-46
      5.2.2.2 转基因株系SL2最佳浓度的确定  46-47
  5.3 讨论  47-49
结论  49-50
参考文献  50-55
附录  55-57
攻读学位期间取得的研究成果  57-58
致谢  58-59
个人简况及联系方式  59-61

AtLEAFY诱导表达对菊花花期调控的研究

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