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红掌‘阿拉巴马’低温相关基因AOX、CAT和APX的表达分析、功能验证及遗传转化体系的构建

作　者: 刘慧春
导　师: 朱祝军
学　校: 浙江大学
专　业: 观赏园艺学
关键词: 红掌 抗寒基因 基因克隆 实时荧光定量RT-PCR 表达分析
分类号: S682.14
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


红掌(Anthurium andraeanum)是天南星科花烛属高档室内观赏盆花,属佛焰花序类植物。红掌由于花型奇特、颜色鲜艳多彩而深受人们喜爱,是居家装饰和馈赠亲友的最好选择,在盆花市场特别是年宵花市场上占了很大比例,因此在浙江省的种植面积正在迅速扩增。而且随着人们生活水平的不断提高,消费理念的转变,对高档盆花的需求越来越大,市场还有着巨大潜力。然而由于红掌原产热带,对温度较为敏感,生长温度要求15℃以上,低于12℃容易产生冷害,低温是限制红掌生长发育的重要逆境因子。在我省种植存在高能耗、高成本的问题,降低了市场竞争力,影响了红掌盆花产业的持续、健康的发展。要解决这个问题的最根本途径就是采用育种手段从根本上提高红掌的抗寒性,对于我省的花卉产业的做大做强则显得十分必要和紧迫。本研究采用PCR结合RACE技术,以红掌‘阿拉巴马’为材料,从其叶片中克隆得到交替氧化酶AOX,过氧化氢酶CAT和抗坏血酸过氧化物酶APX3个基因全长,并对其进行生物信息学分析；运用实时定量PCR技术分析各基因在红掌不同组织器官和不同低温胁迫下的表达情况：构建了红掌抗坏血酸过氧化物酶基因的植物表达载体,并转化烟草进行功能验证；最后,将脂肪酸去饱和酶基因转化红掌并获得了抗性植株。取得的研究结果如下：1、红掌交替氧化酶基因AnAOX全长基因的克隆与序列分析从红掌叶片中克隆与低温胁迫相关的基因AOX,其全长序列为1170bp,命名为AnAOX (GenBank登录号：JX163297),该基因含有1038bp的开放阅读框,编码345个氨基酸,AnAOX编码蛋白预测的等电点(pI)为8.51,分子量大小约为38.0kD。利用DNAMAN5.2.2软件,分析AnAOX基因编码的氨基酸序列,认为该基因具有完整的3’和5’末端,是花烛属红掌交替氧化酶基因的全长序列。红掌AOX推测的氨基酸序列与马铃薯(Solanum tuberosum)、水芭蕉(Lysichiton camtschatcensis)、羽叶蔓绿绒(Philodendron bipinnatifidum)和肾叶臭菘(Symplocarpus renifolius)的AOX的同源性分别为82%、80%、78%和77%。所有的序列中都存在完全保守的铁离子结合区域和组氨酸残基,它们可能与AOX基因在植物中的功能密切相关。2、红掌过氧化氢酶基因AnCAT基因的克隆与序列分析以红掌‘阿拉巴马’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1704bp的过氧化氢酶(Catalase, CAT)基因的cDNA序列,其基因编码区共1476bp,编码492个氨基酸,命名为AnCAT(GenBank登录号：JX163298)。AnCAT编码蛋白预测的等电点(pI)为6.89,相对分子量约为57.1kD。红掌CAT推测的氨基酸序列与与马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、油棕(Elaeis guineensis)、小果野蕉(Musa acuminata)和籼稻(Oryza sativa Indica)的CAT的同源性分别为91%、87%、87%和81%。3、红掌抗坏血酸过氧化物酶基因AnAPX基因的克隆与序列分析以天南星利花烛属红掌‘阿拉巴马’品种叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个888bp的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)基因的cDNA序列,其基因编码区共750bp,编码250个氨基酸,命名为AnAPX(GenBank登录号：JQ8385071)。根据Protparam在线软件预测红掌抗坏血酸过氧化物酶蛋白的理化性质,结果表明推测APX蛋白的分子式为C1232H1904N330O363S7,相对分子量约为27.4kD,等电点(pI)为5.40；理论推导半衰期约30h,不稳定参数为32.55,属于稳定蛋白。红掌APX推测的氨基酸序列与马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、华东葡萄(Vitis pseucdoreticulata)、棉花(Gossypium hirsutum)、油棕(Elaeis guineensis)和玉米(Zea mays)的APX的同源性分别为93%、87%、87%和86%。4、红掌inAOX、AnCAT和AnAPX基因的表达分析通过定量PCR研究上述三个基因在转录水平上表达与红掌叶片低温胁迫之间的关系发现,6℃处理后,,红掌叶片AnAOX, AnCAT和AnAPX基因均上调表达。其中AnAOX基因在低温处理12h后上调表达不明显,处理24h后开始明显上调表达,且处理24h表达量显著高于12h；低温处理超出24h后,表达量略有下降,36～48h之间表达量没有明显差异。AnCAI基因在低温处理12h后表达明显上调,超过12h表达量开始下降,当低温处理时间达到48h时,表达量与对照接近甚至略低于对照；AnAPX基因在低温处理12h明显上调表达,且随着低温处理时间的延长,上调表达逐渐上升,当处理48h后上调表达达到顶峰。由此推测,红掌AnAPX基因表达量的变化与低温及低温持续时间关系最密切,其次是AnAOX基因、AnCAT基因。5、红掌AnAPX植物表达载体的构建根据AnAPX基因全长序列设计特异引物,以红掌‘阿拉巴马’叶片为试材,得到AnAPX基因完整的开放阅读框。将扩增到的片段与pMD18-T载体连接并进行序列测定,表明插入片段正确、克降片段经双酶切消化插入到植物表达载体pCAMBIA2300中,构建了AnAPX基因的表达载体。在成功构建AnAPX表达载体后,采用电击法将重组质粒转化到根癌农杆菌菌株中,为后续AnAPX功能验证莫定了基础。6、汀掌基因转化采用根癌农杆菌介导法,以红掌愈伤组织为侵染材料,将绿色荧光蛋白基因GFP和脂肪酸去饱和酶基因FAD3转化红掌,通过G418和卡那霉素筛选,获得了转基因红掌植株。用PCR反应对具卡那霉素抗性的转基因红掌植株进一步鉴定,结果表明目的基因FAD3已经整合到部分转基因植株的基因组中,成功地获得了转FAD3基因的红掌植株。

全文目录


摘要  14-17
Abstract  17-20
第一章 前言  20-45
  1 植物抗寒分子生物学研究进展  20-37
    1.1 植物抗寒相关基因  20-27
      1.1.1 抗冻蛋白基因  21-22
      1.1.2 冷诱导基因  22-23
      1.1.3 脂肪酸去饱和酶基因  23-24
      1.1.4 抗氧化酶活性基因  24-25
      1.1.5 渗透调节相关酶基因  25-26
      1.1.6 低温信号转录因子  26-27
    1.2 植物基因克隆方法研究进展  27-37
      1.2.1 功能克隆  27-28
      1.2.2 图位克隆  28-29
      1.2.3 转座子标签法  29
      1.2.4 差异显示法  29-32
        1.2.4.1 DDRT-PCR  30-31
        1.2.4.2 RDA  31
        1.2.4.3 SSH  31-32
      1.2.5 RACE法  32-33
      1.2.6 基因芯片技术  33-35
      1.2.7 电子克隆  35-37
  2 红掌研究进展  37-43
    2.1 组织培养  37-38
    2.2 遗传育种  38-41
      2.2.1 种质资源搜集与创新  39
      2.2.2 杂交育种  39
      2.2.3 诱变育种  39-40
      2.2.4 倍性育种  40
      2.2.5 基因工程育种  40-41
    2.3 抗性生理  41-43
  3 本研究的主要内容和技术路线  43-45
    3.1 研究内容  43-44
    3.2 技术路线  44-45
第二章 红掌AOX、CAT和APX基因的克隆与表达分析  45-90
  1 交替氧化酶基因克隆与表达分析  45-65
    1.1 材料与方法  46-56
      1.1.1 试验材料  46
        1.1.1.1 植物材料  46
        1.1.1.2 菌株与质粒  46
        1.1.1.3 各种酶类  46
        1.1.1.4 试剂盒  46
        1.1.1.5 常用储备液  46
      1.1.2 方法  46-56
        1.1.2.1 总RNA的提取  46-47
        1.1.2.2 sscDNA的合成  47-48
        1.1.2.3 引物设计  48
        1.1.2.4 PCR扩增  48-49
        1.1.2.5 3'RACE  49-50
        1.1.2.6 5'RACE  50-53
        1.1.2.7 目的片段的回收及克隆  53-54
        1.1.2.8 红掌AOX全长序列的获得  54-55
        1.1.2.9 基因序列分析及同源性分析  55
        1.1.2.10 实时荧光定量PCR分析  55-56
    1.2 结果与分析  56-64
      1.2.1 总RNA的提取和检测  56
      1.2.2 红掌AOX基因的克隆与分析  56-58
        1.2.2.1 红掌AOX基因cDNA中间片段的扩增  56-57
        1.2.2.2 3'RACE  57
        1.2.2.3 5'RACE  57
        1.2.2.4 红掌AOX基因cDNA全长的拼接  57-58
      1.2.3 AnAOX基因的序列分析与同源性比较  58-62
        1.2.3.1 序列分析  58-59
        1.2.3.2 同源性比较  59-62
      1.2.4 红掌AOX基因的组织表达特性分析  62
      1.2.5 低温胁迫对红掌幼叶叶绿素荧光参数的影响  62-63
      1.2.6 红掌AOX基因在低温胁迫下的表达分析  63-64
    1.3 结论与讨论  64-65
  2 过氧化氢酶基因克隆与表达分析  65-78
    2.1 材料与方法  65-70
      2.1.1 试验材料与试剂  65-66
      2.1.2 方法  66-70
        2.1.2.1 总RNA的提取  66
        2.1.2.2 sscDNA的合成  66
        2.1.2.3 引物的设计  66
        2.1.2.4 PCR扩增  66
        2.1.2.5 3'RACE  66-67
        2.1.2.6 5'RACE  67-68
        2.1.2.7 目的片段的回收及克隆  68-69
        2.1.2.8 红掌CAT全长序列的获得  69
        2.1.2.9 基因序列分析及同源性分析  69
        2.1.2.10 实时荧光定量PCR分析  69-70
    2.2 结果与分析  70-77
      2.2.1 总RNA的提取和检测  70
      2.2.2 红掌CAT基因的克隆与分析  70-73
        2.2.2.1 红掌CAT基因cDNA中间片段的扩增  70
        2.2.2.2 3'RACE  70
        2.2.2.3 5'RACE  70
        2.2.2.4 红掌CAT基因cDNA全长的拼接  70-73
      2.2.3 AnCAT基因的序列分析与同源性比较  73-76
        2.2.3.1 序列分析  73
        2.2.3.2 同源性比较  73-76
      2.2.4 红掌CAT基因的组织表达特性分析  76
      2.2.5 红掌CAT基因在低温胁迫下的表达分析  76-77
    2.3 结论与讨论  77-78
  3 抗坏血酸过氧化物酶基因克隆与表达分析  78-90
    3.1 材料与方法  79-81
      3.1.1 试验材料与试剂  79
      3.1.2 方法  79-81
        3.1.2.1 总RNA的提取  79
        3.1.2.2 sscDNA的合成  79
        3.1.2.3 引物的设计  79-80
        3.1.2.4 PCR扩增  80
        3.1.2.5 3'RACE  80
        3.1.2.6 5'RACE  80
        3.1.2.7 目的片段的回收及克隆  80
        3.1.2.8 红掌APX全长序列的获得  80-81
        3.1.2.9 基因序列分析及同源性分析  81
        3.1.2.10 实时荧光定量PCR分析  81
    3.2 结果与分析  81-89
      3.2.1 总RNA的提取和检测  81-82
      3.2.2 红掌APX基因的克隆与分析  82-84
        3.2.2.1 红掌APX基因cDNA中间片段的扩增  82
        3.2.2.2 3'RACE  82
        3.2.2.3 5'RACE  82
        3.2.2.4 红掌APX基因cDNA全长的拼接  82-84
      3.2.3 AnAPX基因的序列分析与同源性比较  84-87
        3.2.3.1 序列分析  84-85
        3.2.3.2 同源性比较  85-87
      3.2.4 红掌APX基因组织表达特性分析  87-88
      3.2.5 红掌APX基因在低温胁迫下的表达分析  88-89
    3.3 结论与讨论  89-90
第三章 红掌ANAPX基因植物表达载体的构建  90-100
  1 实验材料  90-91
    1.1 菌株和质粒  90
    1.2 酶及分子生物学试剂  90
    1.3 各种实验试剂的配制  90-91
      1.3.1 主要试剂的配制  90
      1.3.2 主要培养基的配制  90-91
    1.4 实验所需引物序列  91
  2 实验方法  91-96
    2.1 目的基因插入片段的获得  91-93
      2.1.1 摇菌  91
      2.1.2 质粒DNA的提取  91-92
      2.1.3 目的片段的双酶切  92
      2.1.4 目的片段的回收  92-93
    2.2 线性载体的获得  93
      2.2.1 质粒载体pCAMBIA2300的双酶切  93
      2.2.2 线性载体的回收  93
    2.3 目的基因与线性载体的连接  93
    2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞  93-94
    2.5 重组质粒的筛选与鉴定  94-95
      2.5.1 重组质粒的DNA提取  94
      2.5.2 重组质粒的酶切鉴定  94-95
      2.5.3 重组质粒的测序验证  95
    2.6 植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105及其鉴定  95-96
      2.6.1 农杆菌感受态细胞的制备  95
      2.6.2 农杆菌感受态的电转化  95
      2.6.3 转化菌的鉴定  95-96
  3 结果与分析  96-99
    3.1 红掌APX基因植物表达载体的构建  96
    3.2 重组质粒的转化农杆菌  96-99
  4 结论与讨论  99-100
第四章 红掌抗坏血酸过氧化物酶基因ANAPX转化烟草  100-115
  1 实验材料  100-101
    1.1 菌种和转化的植物材料  100
    1.2 化学试剂配制  100
    1.3 培养基配制  100-101
  2 实验方法  101-106
    2.1 烟草的组织培养  101
    2.2 根癌农杆菌介导法转化烟草  101
    2.3 转基因植株的鉴定  101-104
      2.3.1 烟草基因组DNA的提取及定量分析  101-102
      2.3.2 烟草总RNA的提取及定量分析  102-103
      2.3.3 烟草总RNA反转录合成cDNA  103-104
      2.3.4 烟草基因组DNA的PCR检测  104
      2.3.5 转基因烟草阳性植株的RT-PCR检测  104
    2.4 转基因烟草阳性植株的抗寒性分析  104-106
      2.4.1 相对电导率测定  105
      2.4.2 丙二醛含量测定  105
      2.4.3 抗氧化酶活性测定  105-106
  3 结果与分析  106-113
    3.1 烟草组培苗的获得  106-107
    3.2 转基因烟草植株的获得  107-108
    3.3 转基因植株的鉴定  108-110
      3.3.1 T0代转基因植株的PCR鉴定  108-109
      3.3.2 T0代转基因烟草植株的实时定量PCR  109-110
    3.4 T0代转基因烟草抗寒性分析  110-113
      3.4.1 相对电导率  110-111
      3.4.2 MDA含量  111
      3.4.3 抗氧化酶活性  111-113
  4 结论与讨论  113-115
第五章 红掌基因转化研究  115-129
  1 材料  115-116
  2 实验方法  116-119
    2.1 不同外植体类型对愈伤诱导的影响  116
    2.2 不同激素类型对愈伤诱导的影响  116
    2.3 不同激素浓度对芽分化/增殖的影响  116
    2.4 愈伤组织和芽的抗生素浓度筛选  116-117
      2.4.1 卡那霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  116
      2.4.2 G_(418)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  116-117
      2.4.3 头孢霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  117
    2.5 农杆菌菌液的制备  117
    2.6 农杆菌菌株类型和菌液侵染时间对红掌愈伤组织转化的影响  117
    2.7 目的基因转化红掌  117-118
      2.7.1 GFP基因转化红掌  117-118
      2.7.2 FAD_3基因转化红掌  118
    2.8 转基因试管苗生根和移栽  118
    2.9 转基因植株的鉴定  118-119
      2.9.1 红掌基因组DNA提取  118-119
      2.9.2 基因组DNA的PCR检测  119
  3 结果与分析  119-127
    3.1 激素类型对愈伤诱导的影响  119-120
    3.2 外植体类型对愈伤诱导的影响  120
    3.3 6-BA浓度对红掌芽增殖的影响  120-122
    3.4 抗生素浓度对愈伤组织/芽生长的影响  122-124
      3.4.1 卡那霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  122
      3.4.2 G_(418)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  122
      3.4.3 头孢霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响  122-124
    3.5 农杆菌菌株类型和菌液侵染时间对红掌愈伤组织转化的影响  124-125
    3.6 转基因植株的获得  125-127
      3.6.1 GFP转基因植株的获得  125-126
      3.6.2 FAD_3转基因植株的获得  126-127
      3.6.3 转基因苗的PCR鉴定  127
  4 结论与讨论  127-129
参考文献  129-153
致谢  153

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