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尤溪金柑等柑橘类种质离体保存及其Fc-MLP2基因克隆与表达

作　者: 金建涛
导　师: 赖钟雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘 尤溪金柑 离体保存 Fc-MLP2基因 qPCR 遗传转化
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本试验以尤溪金柑（金弹Fortunella crassifolia cv. Youxijingan）等柑橘类植物试管苗为材料，进行了尤溪金柑再生体系建立与优化、柑橘类植物种质资源保存、尤溪金柑Fc-MLP2基因的克隆表达、Fc-MLP2基因转化烟草及Fc-MLP2基因功能的初步鉴定等研究。主要结果如下：1尤溪金柑再生体系建立及优化本试验优化筛选出了适合尤溪金柑试管苗增殖和生根的培养基。结果表明：KT对芽的增殖有促进作用；NAA和KT共同作用下，处理G2（MS+NAA0.05mg/L+KT1.5mg/L）的芽增殖系数显著高于其它处理；NAA和BA共同作用下，影响芽增殖的主次因素为BA> BA*NAA>NAA，芽增殖的最优培养基为：MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.05mg/L，增殖系数最高，达到了10.60；影响生根的主次因素为NAA> IBA> NAA*IBA，生根最优培养基为：MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L，生根率最高达到了83.33%，生根数均值达到了3.27个。2尤溪金柑等柑橘类植物种质资源保存本试验以尤溪金柑为材料，研究了培养容器、培养基中的CaCl2、甘露醇和PP333等因素对柑橘种质资源缓慢生长保存的影响。结果表明：当CaCl2的浓度为0.22g/L时，尤溪金柑试管苗的根冠比最大，比较适合柑橘种质资源缓慢生长保存；在CaCl2、甘露醇和PP333共同作用下，分别在保存6个月和12个月时统计试管苗成活率，结果表明：保存6个月和12个月时处理C4(MS+CaCl20.44g/L+甘露醇0g/L+PP3331mg/L)中尤溪金柑试管苗的存活率均为最高，分别达到了100%和97.8%。本试验在原有保存3年的67份柑橘种质资源的基础上新收集了25份柑橘种质资源，并对所收集种质资源试管苗的生长状态进行观察记录。结果显示：柚类种质资源试管苗生长比较健壮，根系发达，叶片大而浓绿，但徒长严重，叶片较为稀疏；野生柑橘类试管苗长势普遍较弱，根系和茎杆都较弱，转接继代时还发现，该类试管苗生根能力也很弱；金柑类和宽皮柑橘类试管苗的长势介于柚类和野生柑橘试管苗之间。3Fc-MLP2基因的克隆与生物信息学分析本试验采用RT-PCR结合RACE技术，第一次以尤溪金柑试管苗为材料，克隆得到尤溪金柑Fc-MLP2基因的全长cDNA序列，其在GenBank中的登录号为JX310276。Fc-MLP2基因全长908bp，含有一个669bp的开放阅读框，编码223个氨基酸。生物信息学分析表明：该蛋白是定位于细胞外的一种疏水性分泌蛋白，具有2个功能位点、13个磷酸化位点和信号肽，其二级结构由α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲组成。系统进化树分析表明：尤溪金柑Fc-MLP2蛋白与粗皮柠檬RlemMLP2蛋白亲缘关系较近，聚为同一类。推测Fc-MLP2蛋白可能在植物抗虫、抗病原菌、抗饥饿和延缓植物衰老方面起到一定作用。4尤溪金柑种质资源保存过程中Fc-MLP2基因的定量表达采用qRT-PCR技术，以18S rRNA基因为内参基因，对尤溪金柑试管苗不同保存阶段Fc-MLP2基因的mRNA转录表达进行研究，结果表明：Fc-MLP2基因在尤溪金柑保存过程中各时期都有表达，保存4个月时相对表达量最高；保存0个月和12个月时Fc-MLP2基因表达量很低，12个月时达到最低；保存8个月时Fc-MLP2基因的表达量与保存6个月时又有所增加，之后随着时间的延长Fc-MLP2基因相对表达量逐渐减少；尤溪金柑保存过程中Fc-MLP2基因的相对表达量与保存过程中尤溪金柑的生长状态密切相关，当尤溪金柑的生长活动较活跃、保存过程中有新叶发出时，Fc-MLP2基因的相对表达量较高。5尤溪金柑Fc-MLP2转化烟草与功能验证本试验通过XbaⅠ和SalⅠ双酶切技术构建pCAMBIA1301-Fc-MLP2表达载体，并转化到农杆菌EHA105中。农杆菌介导法将Fc-MLP2基因导入烟草，潮霉素抗性筛选后对抗性植株进行PCR检测和GUS检测。结果显示：目的基因片段已成功转入到烟草中，转化率为62.22%。低温（4℃）和机械损伤处理转基因烟草，分别在处理后的0、3、6、12、24、48h时取样进行qRT-PCR扩增，检测不同时间段Fc-MLP2基因的表达量变化。结果显示；低温处理后转基因烟草中Fc-MLP2基因相对表达量均显著减少；转基因烟草在受到机械伤害12h后，Fc-MLP2基因相对表达量显著增加。可以推测，Fc-MLP2基因可起到抵御逆境的作用。

全文目录


缩写词  9-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章 引言  15-24
  1 植物种质资源离体保存研究进展  15-19
    1.1 植物种质资源的缓慢生长保存  15-18
      1.1.1 降低保存环境温度  16
      1.1.2 调节培养环境光照条件  16-17
      1.1.3 调节培养基渗透压和添加生长调节剂  17
      1.1.4 调整培养环境的气相条件  17
      1.1.5 调整培养基组分  17-18
      1.1.6 其他方法  18
    1.2 植物种质资源的超低温保存  18-19
    1.3 植物种质资源离体保存存在问题  19
  2 柑橘类植物种质资源离体保存研究进展  19-21
    2.1 组织培养法保存  19-20
      2.1.1 试管苗保存  19-20
      2.1.2 愈伤组织的保存  20
    2.2 超低温保存  20-21
    2.3 柑橘类植物试管苗再生体系研究  21
  3 植物 MLP2 基因的研究进展  21-22
    3.1 MLP 结构与功能  21-22
    3.2 MLP2 基因克隆与表达研究  22
  4 植物基因转化烟草的研究  22-23
  5 本研究的目的意义和主要研究内容  23-24
    5.1 本研究的意义  23
    5.2 本研究的主要内容  23-24
第二章 尤溪金柑再生体系的建立与优化  24-36
  1 试验材料和方法  24-26
    1.1 试验材料  24
    1.2 试验方法  24-26
      1.2.1 无菌体系建立  24
      1.2.2 KT 对尤溪金柑试管苗增殖的影响  24-25
      1.2.3 NAA 和 KT 对芽增殖的影响  25
      1.2.4 BA 和 NAA 对芽增殖的影响  25
      1.2.5 NAA 和 IBA 对试管苗生根的影响  25-26
    1.3 数据处理与分析  26
  2 结果分析  26-35
    2.1 KT 对尤溪金柑芽增殖的影响  26-27
    2.2 NAA 和 KT 对尤溪金柑芽增殖的影响  27-29
    2.3 BA 和 NAA 对尤溪金柑芽增殖的影响  29-31
    2.4 不同处理对尤溪金柑生根的影响  31-35
      2.4.1 不同处理对尤溪金柑生根率的影响  31-33
      2.4.2 不同处理对尤溪金柑生根数的影响  33-35
  3 讨论  35-36
第三章 尤溪金柑等柑橘类植物种质资源的离体保存研究  36-52
  第一节 尤溪金柑种质资源离体保存条件的探讨与优化  36-46
    1 材料方法  36-37
      1.1 材料  36
      1.2 方法  36-37
        1.2.1 不同容器对尤溪金柑离体种质保存的影响  37
        1.2.2 培养基中 CaCl_2浓度对尤溪金柑离体种质保存的影响  37
        1.2.3 不同处理对尤溪金柑离体种质保存的影响  37
    2 结果分析  37-45
      2.1 不同容器对尤溪金柑试管苗缓慢生长保存的影响  37-39
      2.2 CaCl_2对尤溪金柑试管苗缓慢生长保存的影响  39-40
      2.3 CaCl_2、甘露醇和 PP333对尤溪金柑试管苗缓慢生长保存的影响  40-45
        2.3.1 保存 6 个月后存活率  40-42
        2.3.2 保存 12 个月后存活率  42-45
    3 讨论  45-46
      3.1 低浓度的 CaCl_2和小容积的培养容器有利于尤溪金柑试管苗的中长期保存  45-46
      3.2 培养基中添加适当浓度的 CaCl_2和 PP333可提高尤溪金柑试管苗存活率  46
  第二节 92 份柑橘种质资源试管苗离体保存与生长状态观察  46-52
    1 材料与方法  47
    2 结果分析  47-50
      2.1 原有的 67 份柑橘种质资源生长状态观察  47
      2.2 25 份新收集柑橘种质资源  47-48
      2.3 25 份柑橘种质资源的观察  48-50
    3 讨论  50-52
      3.1 不同基因型的柑橘种质资源试管苗生长状态不同  50
      3.2 试管苗离体保存柑橘种质资源优势明显  50-52
第四章 尤溪金柑试管苗 Fc-MLP2 基因的克隆  52-65
  1 材料与方法  52-54
    1.1 材料  52-53
    1.2 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因保守区的克隆  53
    1.3 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因 3’RACE  53
    1.4 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因 5’RACE  53-54
    1.5 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因全长的拼接及 ORF 验证  54
    1.6 尤溪金柑 Fc-MLP2 生物信息学分析  54
  2 结果与分析  54-63
    2.1 尤溪金柑试管苗叶片总 RNA 的提取  54-55
    2.2 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因全长的克隆  55-56
      2.2.1 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因保守区克隆  55
      2.2.2 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因 3′RACE  55
      2.2.3 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因 5′RACE  55-56
      2.2.4 尤溪金柑 Fc-MLP2 基因全长拼接与 ORF 验证  56
    2.3 尤溪金柑 Fc-MLP2 序列的生物信息学分析  56-63
      2.3.1 尤溪金柑 Fc-MLP2 序列理化性质及亲疏水性预测分析  56-57
      2.3.2 尤溪金柑 Fc-MLP2 的信号肽和亚细胞定位预测分析  57-58
      2.3.3 尤溪金柑 Fc-MLP2 跨膜结构预测分析  58-59
      2.3.4 尤溪金柑 Fc-MLP2 磷酸化位点、功能位点和保守结构域的预测分析  59-60
      2.3.5 尤溪金柑 Fc-MLP2 二级结构、三级结构和卷曲螺旋的预测分析  60-62
      2.3.6 尤溪金柑 Fc-MLP2 氨基酸序列分析及系统进化树的构建  62-63
  3 讨论  63-65
第五章 Fc-MLP2 基因的荧光定量 PCR 分析  65-72
  1 材料和方法  65-67
    1.1 材料  65
    1.2 试剂与仪器  65
    1.3 方法  65-67
      1.3.1 尤溪金柑不同保存时期试管苗材料的获得  65
      1.3.2 总 RNA 的提取及质量鉴定  65-66
      1.3.3 cDNA 合成  66
      1.3.4 Fc-MLP2 基因的实时荧光定量 PCR  66-67
  2 结果分析  67-70
    2.1 尤溪金柑不同保存时期材料的总 RNA 的提取及质量鉴定  67
    2.2 标准曲线建立  67-68
    2.3 内参基因 18S rRNA 和目的基因 Fc-MLP2 的特异性扩增  68-69
    2.4 尤溪金柑不同保存时期 Fc-MLP2 基因的相对定量表达分析  69-70
  3 讨论  70-72
    3.1 Fc-MLP2 基因与尤溪金柑保存状态有关  70-71
    3.2 Fc-MLP2 基因在尤溪金柑保存中的作用  71-72
第六章 Fc-MLP2 基因转化烟草与功能鉴定研究  72-84
  1 材料与方法  72-74
    1.1 材料  72-73
      1.1.1 植物材料及所用菌株和质粒  72
      1.1.2 培养基  72
      1.1.3 试剂  72
      1.1.4 PCR 引物  72-73
    1.2 方法  73-74
      1.2.1 载体构建及农杆菌的培养  73
      1.2.2 根癌农杆菌转化烟草叶片  73
      1.2.3 转基因植株的检测  73-74
      1.2.4 低温对转基因烟草 Fc-MLP2 基因表达的影响  74
      1.2.5 机械损伤对转基因烟草 Fc-MLP2 基因表达的影响  74
  2 结果与分析  74-82
    2.1 载体构建及重组子鉴定  74-75
    2.2 转基因植株检测  75-77
      2.2.1 转基因植株的 DNA 水平检测  75-76
      2.2.2 转基因植株的 GUS 检测  76-77
      2.2.3 RNA 转录水平检测  77
    2.3 转基因烟草定量表达分析  77-82
      2.3.1 标准曲线建立  77
      2.3.2 低温对转基因烟草 Fc-MLP2 基因表达的影响  77-80
      2.3.3 机械损伤对转基因烟草 Fc-MLP2 基因表达的影响  80-82
  3 讨论  82-84
    3.1 pCAMBIA1301- Fc-MLP2 载体的优点  82
    3.2 低温处理下转基因烟草中 Fc-MLP2 基因的相对表达量降低  82-83
    3.3 Fc-MLP2 基因在植物抵御机械伤害上有一定作用  83-84
第七章 小结  84-87
  1 尤溪金柑再生体系建立及优化  84
  2 尤溪金柑等柑橘类植物种质资源保存  84-85
    2.1 尤溪金柑种质资源离体保存条件的探讨与优化  84
    2.2 25 份柑橘种质资源保存体系建立与生长状态观察  84-85
  3 Fc-MLP2 基因的克隆与生物信息学分析  85
  4 尤溪金柑种质资源保存过程中 Fc-MLP2 基因的定量表达  85-86
  5 Fc-MLP2 基因转化烟草的研究  86-87
参考文献  87-95
附录  95-106
致谢  106

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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