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田间愈伤组织途径诱导枣和酸枣多倍体研究

作　者: 石庆华
导　师: 刘孟军; 刘平
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枣酸枣活体愈伤组织不定芽纯合多倍体
分类号: S665.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

枣树（Ziziphus jujuba Mill.）是我国原产特色优势树种，由于杂交育种难度大，多倍体育种备受关注。本研究通过在田间利用秋水仙素处理对枣树枝条截面愈伤组织细胞的染色体数目加倍、经过芽再生及倍性鉴定，建立了免混倍体纯化、简便高效的多倍体诱导技术体系和倍性鉴定体系，并研究了再生芽的起源。主要研究结果如下：1．利用生长调节剂于枝干环剥伤口处进行愈伤组织诱导和芽的再生，结果表明，环剥伤口处很容易诱导产生愈伤组织但较难再生不定芽。环剥后4-5d就能观察到少量愈伤组织，但40d后愈伤组织内部木质化，没有不定芽产生。2．研究了幼龄枝（1-3年生枝）截面愈伤组织芽再生体系的影响因素，包括基因型、枝龄和茎粗、截枝时期及TDZ浓度。芽再生的难易受基因型影响较大，‘月光’、‘大荔龙枣’和酸枣‘邢台0605’易出芽，截枝并诱导后15d开始有不定芽出现，20d后‘月光’的平均单枝截面出芽数高达6.92个，而‘冬枣’为难出芽基因型，截枝后15d没有不定芽出现，20d后平均单枝截面出芽数也仅为0.11。对易出芽基因型（‘大荔龙枣’）而言：从5月中旬到8月中旬均能很容易诱导截面产生愈伤组织并再生不定芽，20d后的平均单枝截面出芽数高达4.78个；较适宜的枝条截面直径为15-25mm，同等粗度枝条，新稍比一年生枝截面愈伤的芽再生效果好。对不易出芽基因型（‘冬枣’‘赞皇大枣’）而言：提高TDZ浓度在一定范围内能提高出芽数量，但没能加快出芽的速度，优化后的TDZ浓度为8mg/L和12mg/L，截枝后40d平均单枝截面出芽数可达0.75个。3．研究了幼龄枝（1-3年生枝）截面愈伤组织多倍体诱变体系的影响因素，包括枝龄、基因型、秋水仙素剂量及诱变时间。通过比较发现，幼龄枝既容易再生不定芽，也容易获得变异芽；对20个枣基因型和37个酸枣基因型进行愈伤组织诱导和秋水仙素诱变，发现不定芽的再生受基因型影响很大，其中11个枣基因型和24个酸枣基因型实现了芽的再生，共获得了4个枣基因型（‘大荔龙枣’,‘金丝小枣’,‘无核68’,‘毛卜彦铃枣’）和9个酸枣基因型（‘邢台0604’,‘邢台0605’,‘邢台0608’,‘邢台0610’,‘邢台0618’,‘邢台0641’,‘北奇11号’,‘资源圃8’,‘酸枣17号’）的纯四倍体材料；适宜的秋水仙素处理为截枝诱导后3d用0.05%的秋水仙素处理1次（12h），在处理的12个枝条截面上获得5个纯四倍体芽，其中2个当年开花。4．对不同倍性不定芽的发育过程进行了观察比较。和二倍体相比，变异芽在嫩芽阶段均表现粗壮；枝条未木质化阶段，四倍体生长粗壮，八倍体生长缓慢，混倍体枝条卷曲；结果枝叶片展平阶段，和二倍体相比，四倍体叶片明显宽大，八倍体叶片反而较小；不同倍性材料成熟叶片的形态特点和结果枝展平叶片基本相同。结合流式细胞仪鉴定，发现根据结果枝叶片展平阶段的形态学鉴定和流式细胞仪鉴定结果差异不显著，即通过肉眼观察枣吊幼嫩叶片的形态特点就能较准确地鉴定再生芽的倍性。此外，通过二倍体诱导可同时获得四倍体、八倍体等。5．系统研究了不同倍性材料的形态学特点和组织解剖学特点。研究表明，和二倍体相比，四倍体叶片明显宽大，八倍体叶片反而变小；随倍性增加，气孔变大，气孔密度减小（气孔纵径比例：4x/2x≈1.5，8x/4x≈1.4，8x/2x≈2）；四倍体花粉粒也显著变大，约为二倍体花粉直径的1.3倍。6．通过肉眼、解剖镜、显微镜观察，对田间愈伤组织途径芽的起源进行了研究。芽的再生主要有两种途径，一是胚状体途径，二是不定芽途径，其中胚状体途径极其少见，仅在酸枣中有所发现。显微镜观察发现，形成层细胞首先通过不断分裂增殖形成愈伤组织细胞团，进而细胞团中特异细胞分化出不定芽原基，并逐步分化输导组织最终与母体相连，且不定芽的发育具有不同步性。观察结果可确定不定芽起源于截面新生的愈伤组织，推测不定芽可能来源于形成层某个或少数几个细胞。截枝诱导愈伤组织后，随秋水仙素处理时间延后，混倍体比例增加。诱导愈伤组织后第10d用秋水仙素处理，混倍体比例达17.65%，可能来源于多个染色体未完全加倍细胞；纯合多倍体比例达23.53%，可能来源于染色体加倍的单细胞。7.利用田间愈伤组织芽再生和多倍体诱变技术在榆树、海棠、桑树和五角枫4种木本植物进行了多倍体诱变。其中，在榆树、海棠、五角枫的截面上得到了愈伤组织，在榆树上还成功实现了愈伤组织不定芽再生并获得了纯多倍体。

田间愈伤组织途径诱导枣和酸枣多倍体研究

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