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长江口中华鲟幼鱼鳃丝Na~+，K~+-ATPase基因克隆、表达和酶的定位

作　者: 封苏娅
导　师: 庄平
学　校: 华东理工大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 中华鲟非致死活体取样基因表达免疫组织化学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

中华鲟为我国特有珍稀物种。迄今为止,国内学者在中华鲟幼鱼渗透调节方面开展了一些积极有益的研究,但这些研究还远不能满足中华鲟保护工作的需求,本论文从基因克隆、表达、离子转运蛋白定位三个方面入手,初步系统地研究了中华鲟幼鱼渗透调节的分子机制。为了建立鲟鱼的非致死鳃组织取样技术,分别在实验开始和结束时检测活体取样组、对照组及淡水组中鲟鱼生长指标、血清渗透压、离子浓度、鳃丝Na+K+-ATPase(NKA)活性的变化,结果显示,非致死活体取样方法对鲟鱼的生长特性没有显著影响。活体取样实验组和对照组的各项生长指标(体长、全长、体重),血清渗透压、离子浓度、NKA活性均无显著性差异(P>0.05),淡水组与盐度10条件下的实验组相比,其生长指标无显著差异,但血清离子、渗透压及NKA活性有显著差异(P<0.05)。盐度10条件下活体取样实验组的上述生理指标显著高于淡水组。说明经活体取样的鲟鱼能够正常进行渗透调节。为了研究盐度10条件下中华鲟幼鱼鳃丝Na+,K+-ATPase(NKA)α亚基的分子调节机制,采用克隆方法得到中华鲟幼鱼鳃丝NKAα亚基部分基因序列,该序列与其他鱼类相同类型的亚基序列比对显示其为较保守的编码区开放阅读框。在鲟鱼转移后3、6、12、24、48、72和96 h检测实验组(淡水-盐水)和对照组(淡水-淡水)中华鲟幼鱼鳃丝NKAα亚基的mRNA表达水平、鳃丝NKA活性、血清Na+、Cl-的浓度和渗透压。结果显示：在转移后0～12 h,实验组中的mRNA表达量与酶活性为适应盐度变化而显著增加(P<0.05),离子浓度和渗透压均显著上升(P<0.05)；在转移后12～24 h,mRNA表达和酶活性开始降低,但仍然显著高于对照组的值(P<0.05),离子渗透压的变化与酶活性及mRNA变化趋势一致,这表明中华鲟鳃丝NKA在应对盐度变化时通过改变mRNA表达量来增加酶活性,高活性NKA调节血清离子和渗透压平衡。为确定中华鲟幼鱼鳃丝Na+,K+-ATPase(NKA)和Na+/K+/2Cl-(NKCC)转运子在组织中分布,通过免疫组织化学的方法检测两种酶的免疫反应。结果显示,NKA广泛分布于鳃丝和鳃小叶上,其中盐度组的NKA免疫阳性细胞数量显著多于淡水组,盐度组细胞的荧光强度大于淡水组。在细胞中除核外,NKA普遍分布在细胞质中；NKCC广泛分布在鳃小叶上,盐度组NKCC免疫阳性细胞数量与淡水组相比无显著差异,但其细胞形态发生变化,盐度组细胞荧光强度增强且单个细胞的荧光区域边缘呈现不规则褶皱,NKCC同样在细胞质中广泛存在,但荧光强度较NKA弱,显示其蛋白的量较少。在相同组织区域的NKA和NKCC分布在不同细胞中。本研究结果表明盐度影响NKA和NKCC的分布。

长江口中华鲟幼鱼鳃丝Na~+，K~+-ATPase基因克隆、表达和酶的定位

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