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抗寒无核葡萄胚挽救及VaERD基因功能研究

作　者: 赵凯
导　师: 张剑侠
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 山葡萄无核葡萄抗寒性胚挽救 VaERD基因功能
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

欧亚种无核葡萄品质优良，但抗寒性差，不利于寒冷地区的发展。中国具有丰富的野生葡萄资源，其中抗寒性最强的山葡萄，能耐-40℃的低温，是十分重要的抗寒种质资源。因此，将山葡萄的抗寒性状与无核葡萄的优质性状相结合是培育抗寒无核葡萄新品种的一个有效策略。同时，研究山葡萄的抗寒相关基因对于弄清山葡萄的抗寒分子机制及进一步的分子育种具有重要意义。本研究以抗寒的欧山杂种作父本，以欧亚种无核葡萄作母本，进行了抗寒无核葡萄胚挽救研究；并对前期获得的山葡萄抗寒相关VaERD基因进行了功能研究。取得的主要结果如下：1、抗寒无核葡萄胚挽救研究（1）不同培养基对胚挽救效果的影响将8个葡萄杂交组合的胚珠分别接种到ER、ER+CH500mg/L、ER+CH500mg/L+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L三种培养基中培养。结果表明，培养基不同，胚发育率及成苗率也不同，添加CH和GA3+IAA对胚发育率及成苗率不存在显著影响（P＞0.05）。在ER+CH500mg/L+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L培养基上获得最大的胚发育率及萌发率。（2）氨基酸对胚挽救效果的影响将波尔莱特×北醇的杂交胚珠分别接种到添加1mmol/L丝氨酸、天冬氨酸、烟酸、半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸的ER培养基上，并以ER基本培养基作对照进行培养。结果表明，对照中胚的发育率为8.89%，添加丝氨酸使胚的发育率达到20.74%；添加天冬氨酸和半胱氨酸使胚的发育率分别达到10.67%和11.67%；但添加烟酸、甘氨酸及脯氨酸时胚的发育率与对照相比有所降低，分别为1.67%、5.19%和6.00%。丝氨酸的添加比其他5种氨基酸更能促进胚的成苗率，达到7.41%。丝氨酸和烟酸的添加对胚发育率有显著性影响（P＜0.05）。丝氨酸的添加表现为对胚发育率和成苗率起促进作用，而烟酸的添加表现为对胚的发育起抑制作用。（3）父母本对无核葡萄胚挽救的影响在以00-1-5（玫瑰香×黑龙江实生）为父本的5个杂交组合中，以京大晶为母本获得了最大的胚发育率及成苗率，分别为36.66%和4.16%。这表明在以00-1-5为父本时，京大晶比其他4种无核葡萄品种更适于做母本。以京大晶为母本对胚发育率和成苗率具有显著性影响（P＜0.05）。在以北醇为父本的杂交组合中，红无籽露及皇家秋天获得了相同的胚发育率及成苗率，分别为13.33%和2.22%。这说明分别以红无籽露及皇家秋天做母本对胚的发育率及成苗率影响不大。以红无籽露、皇家秋天做母本，分别以00-1-5和北醇做父本，胚的发育率和成苗率存在一定差异，以北醇做父本比00-1-5做父本的胚发育率和成苗率有所提高，但二者差异不显著（P＞0.05）。2、山葡萄抗寒相关VaERD基因的功能研究（1）VaERD亚细胞定位分析GFP蛋白可在激发光下发出绿色荧光，根据这种特性可借助激光共聚焦显微镜观察转录因子与GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中绿色荧光的分布位置。分析结果表明，融合表达载体35S:VaERD-GFP转化过的洋葱表皮，仅在核内观察到绿色荧光的存在。而阴性对照GFP载体在整个洋葱表皮细胞内都能显示绿色荧光，该现象说明VaERD具有核定位功能。（2）VaERD转录自激活分析将VaERD基因全长克隆至表达载体pGBKT7中，采用冻融法将融合表达载体及阳性对照和阴性对照转化酵母菌AH109。将转化后的酵母菌液涂布于适当SD选择培养基上，在30°C条件下倒置培养，直到菌落出现。分别挑取转化菌株在一缺SD培养基（‐Trp）和涂布有X‐α‐gal的三缺SD培养基（‐Trp‐His‐Ade）上培养，结果表明VaERD转化菌株能够在含X‐α‐gal的三缺SD（‐Trp‐His‐Ade）和一缺SD培养基（‐Trp）上生长，并能激活第二报告基因MEL1，使底物X‐α‐gal显性出蓝色。而阴性对照只含有筛选标记基因Trp，因而只能在一缺SD培养基（‐Trp）上生长，而不能在三缺SD（‐Tr）基上生长。此结果表明VaERD在酵母中具有转录激活功能。（3）山葡萄抗寒相关基因VaERD转化拟南芥研究构建植物表达载体pCAMBIA3301-VaERD，并电击法导入农杆菌GV3101，通过农杆菌介导的花序浸沾法对拟南芥进行转化，并收取种子。通过抗生素筛选共获得转化植株20株，经PCR检测获得阳性植株17株。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章文献综述  13-29
  1.1 胚挽救  13-19
    1.1.1 胚挽救技术  13
    1.1.2 无核葡萄育种  13-15
    1.1.3 胚挽救技术在葡萄育种中的应用  15-16
    1.1.4 影响无核葡萄胚挽救的因素  16-19
  1.2 植物的抗寒性  19-27
    1.2.1 植物抗寒性研究进展  19-21
    1.2.2 植物抗寒相关基因  21-24
    1.2.3 葡萄抗寒种质资源  24-25
    1.2.4 葡萄抗寒育种研究进展  25-26
    1.2.5 植物转基因的方法  26-27
  1.3 本研究的目的及意义  27-29
第二章抗寒无核胚挽救影响因素研究  29-37
  2.1 材料与方法  29-30
    2.1.1 植物材料  29
    2.1.2 方法  29-30
  2.2 结果与分析  30-34
    2.2.1 不同培养基对胚挽救效果的影响  30-31
    2.2.2 氨基酸对胚挽救效果的影响  31-32
    2.2.3 父母本基因型对无核葡萄胚挽救的影响  32-34
  2.3 讨论  34-37
    2.3.1 不同培养基对胚挽救效果的影响  34-35
    2.3.2 氨基酸对胚挽救效果的影响  35
    2.3.3 父母本基因型对无核葡萄胚挽救的影响  35-37
第三章抗寒相关基因 VaERD 功能研究  37-49
  3.1 材料  37
    3.1.1 材料  37
    3.1.2 主要试剂  37
    3.1.3 主要仪器设备  37
  3.2 方法  37-44
    3.2.1 VaERD 亚细胞定位  37-40
    3.2.2 酵母转录激活活性验证  40-42
    3.2.3 VaERD 转化拟南芥研究  42-44
  3.3 结果与分析  44-47
    3.3.1 VaERD 核定位功能分析  44-45
    3.3.2 VaERD 转录激活活性分析  45-46
    3.3.3 VaERD 转化拟南芥研究  46-47
  3.4 讨论  47-49
第四章结论  49-50
参考文献  50-59
致谢  59-60
作者简介  60

抗寒无核葡萄胚挽救及VaERD基因功能研究

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