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葡萄过氧化氢酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学特性的初级研究

作　者: 贾晨晨
导　师: 姚泉洪
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 过氧化氢酶葡萄过氧化氢酶分泌表达蛋白纯化
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

过氧化氢酶(Hydrogen peroxidase),又称触酶(Catalase,简称CAT),是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是以过氧化氢为底物,通过催化一对电子的转移而将其分解为水和氧气。在植物中CAT清除光呼吸、线粒体电子传递及脂肪酸β-氧化等过程中产生的H2O2。大量研究表明,CAT在植物防御、胁迫应答、延缓衰老及控制细胞的氧化还原平衡等方面起重要作用。成功构建了葡萄过氧化氢酶(VvCAT)的表达质粒,在毕赤酵母中表达并得到纯化的过氧化氢酶,从而进一步研究过氧化氢酶的酶学特性,可以为该酶在植物新陈代谢的生理功能提供了研究基础。本研究通过重叠延伸PCR技术消除VvCAT基因内部的BamH|切点,根据毕赤酵母密码子的偏好性进行改造。为了进一步研究VvCAT蛋白的酶学特性,通过电击转化法将带有目的基因的重组质粒表达载体转化毕赤酵母,添加了AOX1启动子使其在毕赤酵母中进行甲醇诱导分泌表达。对表达的葡萄过氧化氢酶使用6×His与镍柱结合的方法进行纯化与蛋白定量,通过对其进行SDS-PAGE电泳,得到葡萄过氧化氢酶的分子量为55KD左右。对VvCAT进行酶学性质分析,得到其对于底物H2O2的最适反应温度与pH值分别为40℃和9.0,在30℃是温度稳定性最高,对碱性范围内的缓冲环境具有良好的稳定性,对金属离子Mn2+高度敏感产生抑制作用,K+、A13+可以提高酶的活性。葡萄的过氧化氢酶对于底物过氧化氢的酶反应动力学常数Km值为4.806mmol/L,Vmax为102.04μmol mg-1min-1。叠氮化钠、盐酸羟胺以及抗坏血酸对于酶的活性有强烈的抑制作用,并且单功能过氧化氢酶的专一抑制剂3-氨基-1,2,4三唑也会抑制酶活。以愈创木酚检测酶的过氧化物酶活性,没有出现明显的颜色反应。由此可知该酶为单一功能过氧化酶。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语说明  9-10
第一章文献综述  10-22
  1 过氧化氢酶的研究  10-16
    1.1 过氧化氢酶的概述  10
    1.2 过氧化氢酶的性质  10-13
    1.3 过氧化氢酶的应用  13-15
    1.4 过氧化氢酶的生理功能  15-16
  2 毕赤酵母表达系统  16-20
    2.1 常用表达菌株及表达载体  17-18
    2.2 外源基因的转化与整合  18
    2.3 表达蛋白翻译后修饰  18
    2.4 影响外源蛋白表达的因素  18-20
  3 研究的目的和意义  20-22
    3.1 研究目的  20
    3.2 研究内容  20
    3.3 研究意义  20-22
第二章 VVCAT基因的合成、表达及纯化  22-36
  1 试验材料  22-23
  2 试验方法  23-31
    2.1 引物设计及合成策略  23-24
    2.2 克隆与序列分析  24-25
    2.3 VvCAT基因异源表达及纯化  25-31
  3 结果与分析  31-33
    3.1 VvCAT基因的合成  31
    3.2 VvCAT基因的电击转化及表达  31-32
    3.3 蛋白的纯化与定量  32-33
  4 讨论  33-36
第三章酶学性质的初级研究  36-44
  1 材料和方法  36-38
    1.1 实验材料  36
    1.2 反应体系  36
    1.3 酶学性质研究  36-38
  2 结果与分析  38-43
    2.1 最适pH和pH稳定性  38-39
    2.2 最适温度和温度稳定性  39-40
    2.3 金属离子对酶活性的影响  40-41
    2.4 化学试剂对酶活的影响  41-42
    2.5 酶促反应动力学  42-43
  3 讨论  43-44
参考文献  44-50
全文结论  50-52
本文创新点  52-54
附录1  54-56
附录2  56-58
致谢  58

葡萄过氧化氢酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学特性的初级研究

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