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大豆疫霉效应分子Avh331抑制MAPK介导的植物防卫反应促进病原菌侵染

作　者: 程保平
导　师: 王源超
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉效应分子活性氧迸发胼胝体沉积 MAPK信号途径
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病是威胁全球大豆生产的毁灭性病害之一,每年导致十几亿美元的直接经济损失。培育抗病品种一直是控制该病害的主要策略,但抗病品种选育周期长、有效抗源少、病原变异快速等原因使传统的抗病育种手段难以满足农业生产的需要。疫霉菌属于茸鞭生物界,与其他真菌遗传距离很远,其可能拥有一套与其他真菌不同的致病机制,因此迫切需要从分子水平上阐述其致病机理,为有效利用植物的抗病机制设计植物疫病控制新策略提供理论依据。抑制植物抗病相关基因表达的大豆疫霉效应分子的筛选.大豆疫霉是半活体营养的病原卵菌,在侵染初期营活体寄生,因此抑制植物的基础防卫反应对大豆疫霉的侵染非常重要。最近的研究发现：疫霉菌在侵染过程中分泌大量RxLR类效应分子,推测这些效应分子可以抑制植物的防卫反应促进自身的侵染。生物信息学分析发现大豆疫霉基因组中编码超过350个RxLR家族效应分子,本文选取了30个在侵染早期表达的效应分子,并将其在植物原生质体中瞬时表达,结果发现与空载体对照相比有16个效应分子可使植物抗病相关基因FRK1的表达下调2倍以上。构建效应分子的植物表达载体进行植物转化,获得效应分子的转基因植株并进行病原菌接种试验,发现3个效应分子Avr4/6、Avr3c、Avh331可在转基因植株中行使毒性功能促进病原菌的侵染,其中Avh331对植物的毒性最强。效应分子Avh331可以抑制疫霉激发子诱导的基础防卫反应并促进疫霉菌的侵染.通过病原菌接种实验发现Avh331转基因植株对疫霉病原菌的感病性明显提高：病原菌接种7天后,野生型植株病情指数为42,而Avh331转基因植株病情指数可达75。在野生型植株上注射疫霉激发子后发现其可激发植物MAPK激酶活性,诱导植物活性氧迸发和胼胝体的沉积；而在转基因植株上注射疫霉激发子后发现：其在Avh331转基因植株上诱导的活性氧迸发的强度可降至野生型植株的45%,诱导胼胝体沉积量可降至野生型植株的的56%,说明Avh331可通过抑制疫霉激发子诱导的植物基础防卫反应来促进疫霉菌的侵染。效应分子Avh331可抑制细菌鞭毛肽flg22诱导的植物抗病反应并促进细菌的侵染。在转基因植株上接种细菌病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,发现在Avh331转基因植株上细菌接种Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000三天后遵长的菌落数与野生型植株相比并无显著增多,可能是的效应分子对植物的毒性较强掩盖了Avh331的毒性。在转基因植株上接种缺失Ⅲ型分泌系统结构基因的Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000hrcC突变体,发现在Avh331的转基因植株上细菌突变体接种三天后增长的菌落数比野生型植株多3-4倍。综上所述Avh331转基因植株对疫霉菌和细菌的生长更加敏感,这也说明Avh331转基因植株对广谱病原菌具有感病性。已有报道称在野生型的植株上细菌鞭毛肽flg22可通过MAPK级联复合物诱导活性氧迸发和胼胝体的沉积,本研究在转基因植株上注射flg22,发现其在Avh331转基因植株上诱导活性氧迸发的强度可降至野生型植株的39%,诱导胼胝体沉积量可降至野生型植株的47%。说明Avh331通过抑制细菌PAMP flg22诱导的MAPK信号途径促进病原菌的侵染。Avh331作用于MAPK信号途径下游抑制植物的防卫反应.Avh331在植物原生质体中瞬时表达可抑制flg22或MKK5DD诱导的防卫相关基因FRKl的表达,用flg22或疫霉激发子处理Avh331的转基因植株后用real-time PCR检测植物MAPK下游抗病相关基因FRK1、WRKY22、WRKY29的表达,发现与空载体对照相比Avh331可使这些基因的下调表达2-4倍,但Avh331并不能直接抑制植物MAPK激酶活性,说明Avh331可能作用于MAPK下游来行使其毒性功能。为了进一步验证这个推论,本研究在另一种独立的植-微互作体系中研究了Avh331对植物MAPK信号途径的影响。在烟草叶片中过表达Avh331后接种疫霉菌可显著增大疫霉菌水渍状病斑的面积,说明Avh331可以抑制烟草的抗病反应促进疫霉菌的侵染。已有报道称疫霉激发子INF1可通过MAPK信号途径诱发植物的防卫反应。本研究在烟草叶片中同时表达Avh331与INF1,发现与Avh331可完全抑制INF1诱导的活性氧迸发。进一步实验表明在烟草中Avh331可完全抑制烟草激酶NPK1、NtMEK2DD或SIPK诱导的植物活性氧迸发和程序性细胞死亡。而蛋白互做实验证明Avh331与这些烟草激酶并无互作,说明Avh331在烟草中可能同样作用于MAPK信号通路下游抑制植物的防卫反应。综上所述：本研究在两种独立的植-微互作体系中研究了Avh331的毒性功能,得出了一致的结论：Avh331可作用于MAPK信号通路的下游来抑制植物的防卫反应。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
引言  11-13
文献综述  13-43
  第一章细菌病原菌效应分子的研究进展  14-28
    摘要  14
    ABSTRACT  14-15
    1 细菌的病原特征分子  15
    2 病原特征分子的识别受体  15-17
    3 病原特征分子激活的抗病反应  17-19
    4 Ⅲ型分泌系统  19-21
      4.1 Ⅲ型分泌系统功能研究  19
      4.2 Ⅲ型分泌系统结构研究  19-21
    5 细菌效应分子对PTI的抑制  21-23
      5.1 AvrB毒性功能研究  21-22
      5.2 AvrRpt2与AvrRpml毒性功能研究  22
      5.3 Coronatine毒性功能研究  22
      5.4 AvrPto与AvrPtoB毒性功能研究  22-23
      5.5 HopAI1毒性功能研究  23
    参考文献  23-28
  第二章植物卵菌病原菌效应分子研究进展  28-43
    摘要  28
    ABSTRACT  28-29
    1 卵菌病害  29-30
    2 卵菌生活史简介  30
    3 卵菌的效应分子  30-36
      3.1 效应分子序列结构  30-33
      3.2 质外体效应分子  33-35
        3.2.1 蛋白酶抑制剂质外体效应分子  33-34
        3.2.2 毒素质外体效应分子  34
        3.2.3 激发子质外体效应分子  34-35
      3.3 细胞质效应分子  35-36
        3.3.1 RXLR效应分子  35
        3.3.2 CRN效应分子  35-36
        3.3.3 胞质效应分子的转运  36
    4 效应分子对植物免疫系统的影响  36-37
      4.1 效应分子与植物先天免疫系统  36-37
      4.2 效应分子与PTI  37
      4.3 效应分子与ETI  37
    参考文献  37-43
研究内容  43-100
  第一章抑制植物抗病相关基因表达的大豆疫霉效应分子筛选  44-62
    摘要  44
    ABSTRACT  44-46
    1 材料与方法  46-49
      1.1 植物品种和菌株  46
      1.2 质粒载体  46
      1.3 酶和试剂  46
      1.4 PCR反应  46-47
      1.5 电击感受态细胞的制备  47
      1.6 细菌电击转化  47
      1.7 植物培养  47
      1.8 植物转化  47-48
      1.9 农杆菌质粒DNA的提取  48
      1.10 Western杂交  48-49
      1.11 原生质体中报告基因活性测定  49
      1.12 细菌生长测定  49
    2 结果与分析  49-57
      2.1 大豆疫霉效应分子选择及载体构建  49-50
      2.2 植物原生质体中瞬时表达效应分子  50-52
      2.3 在野生型植株Col-0的原生质体中效应分子对植物抗病相关基因表达的影响  52-54
      2.4 在rar1突变体植株的原生质体中效应分子对植物抗病相关基因表达的影响  54-55
      2.5 在sgt1b突变体植株的原生质体中效应分子对植物抗病相关基因表达的影响  55-57
    3 讨论与结论  57-59
    参考文献  59-62
  第二章效应分子Avh331对疫霉激发子诱导的基础防卫反应的影响  62-74
    摘要  62
    ABSTRACT  62-63
    1 材料与方法  63-65
      1.1 Real-Time PCR  63-64
      1.2 疫霉菌丝基因组DNA的提取  64-65
      1.3 疫霉激发子的制备  65
      1.4 活性氧测定  65
    2 结果与分析  65-69
      2.1 Avh331可以促进疫霉菌在植物上的侵染  65-67
      2.2 疫霉激发子可以激活植物MAPK的激酶活性  67-68
      2.3 Avh331可以抑制疫霉激发子诱导的活性氧迸发  68
      2.4 Avh331可以抑制疫霉激发子诱导的胼胝质沉积  68-69
    3 讨论  69-71
    参考文献  71-74
  第三章效应分子Avh331对细菌鞭毛肽flg22诱导的植物抗病反应的影响  74-86
    摘要  74
    ABSTRACT  74-75
    1 材料与方法  75-77
      1.1 质粒的小量制备  75-76
      1.2 质粒的大量提取  76
      1.3 农杆菌感受态细胞的制备  76
      1.4 农杆菌感受态细胞的转化  76-77
    2 结果与分析  77-80
      2.1 Avh331毒性低于细菌效应分子不能显著促进Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000的侵染  77-78
      2.2 Avh331可以促进Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 hrc~-突变体的侵染  78-79
      2.3 Avh331可以抑制细菌鞭毛肽flg22诱导的活性氧迸发  79-80
      2.4 Avh331可以抑制细菌鞭毛肽flg22诱导的胼胝质沉积  80
    3 讨论  80-82
    参考文献  82-86
  第四章效应分子Avh331对植物MAPK抗病信号途径的影响  86-100
    摘要  86
    ABSTRACT  86-88
    1 材料和方法  88-89
      1.1 供试烟草和供试菌株的保存和培养  88
      1.2 Overlap PCR步骤  88
      1.3 农杆菌注射方法  88
      1.4 在烟草叶片注射表达激酶的方法  88-89
      1.5 烟草cDNA的合成  89
      1.6 DAB染色  89
    2 结果与分析  89-94
      2.1 Avh331可抑制植物MAPK信号途径下游抗病相关基因的表达  89-91
      2.2 激酶NPK1 Δ374、MEK2~(DD)、SIPK瞬时表达引起烟草活性氧进发和细胞死亡  91-92
      2.3 大豆疫霉效应分子Avh331抑制MEK2~(DD)、NPK1 Δ374、SIPK引起的烟草活性氧迸发  92-93
      2.4 大豆疫霉效应分子Avh331抑制MEK2~(DD)、NPK1A374、SIPK引起的烟草细胞死亡  93-94
    3 讨论  94-96
    参考文献  96-100
附录大豆疫霉对寄主表皮穿透能力的相关研究  100-116
附表1 字母缩写  116-118
攻读博士学位期间发表的研究论文  118-120
致谢  120

大豆疫霉效应分子Avh331抑制MAPK介导的植物防卫反应促进病原菌侵染

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