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地肤内生生防细菌的筛选及其生防作用的研究

作　者: 谈静惠
导　师: 王美琴; 郝晓娟
学　校: 山西农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 内生细菌 枯草芽孢杆菌 生防效果 培养条件优化 抗菌蛋白
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


植物内生细菌作为一类新型的资源微生物,在替代或减少农药使用、改善农业生态系统、保持植物微生态系统的生物多样性、实现农业可持续发展方面日益受到重视,是当前国内外的研究热点之一。从植物内生细茵中筛选拮抗活性菌株和寻找新的农用活性代谢产物,可为植物病害防治提供新的资源。本文从地肤体内分离获得108株内生细菌,采用平板对峙法筛选得到5株对番茄灰霉病菌,2株对棉花立枯病菌具有拮抗作用的菌株,其中D-29菌株对2种病原菌均有抑制作用。抑菌谱测定结果显示D-29菌株对12种病原菌均有一定的抑菌作用,对玉米大斑病菌和番茄灰霉病菌拮抗作用最好,抑制率分别为54.6%和50.6%。用D-29发酵液、无菌滤液、茵悬液分别处理病原菌处理过的番茄、梨、玉米叶片,结果表明：D-29发酵液对番茄灰霉病和玉米大斑病的生防效果最好,分别为64.61%、28.8%；D-29菌悬液对梨褐腐病生防效果最佳,为51.62%。通过形态观察、生理生化反应及脂肪酸鉴定法,鉴定D-29菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对D-29菌株发酵条件进行优化,得到最佳初始培养基为：玉米粉10g,麦芽糖30g,碳酸钙1.5g,豆粉30g,水1000mL。最佳培养条件为：250mL三角瓶装液量100mL,初始pH值7,接菌量1%,培养温度28℃,转速170r·min-1。生防机制研究表明：D-29菌株可使灰霉病菌部分菌丝顶端生长畸形,胞内物质外泄,产孢梗畸形;用不同浓度的D-29无菌滤液处理灰霉病菌孢子,100%D-29无菌滤液抑制效果最明显,抑制率高达80%。用硫酸铵分级沉淀法确定80%饱和硫酸铵为最佳盐析饱和度,获得的粗提蛋白耐高温(100℃60min)、对有机溶剂和紫外光照不敏感,耐强酸(pH2-9)。D-29菌株粗蛋白通过DEAE fast flow阴离子交换层析分离得到6个洗脱峰,其中峰Ⅳ、Ⅴ洗脱出的蛋白具有抑菌活性,峰Ⅳ洗脱出的蛋白活性最好,峰面积相对较大。

全文目录


摘要  8-9
第一章 文献综述  9-15
  1.1 植物内生细菌  9
  1.2 植物内生细菌在生物防治上的应用  9-11
  1.3 植物内生细菌的开发  11-13
    1.3.1 植物微繁系统(micropropagation)的生物化或细菌化(bacterization)  11
    1.3.2 植物修复  11
    1.3.3 果蔬采后保鲜剂  11-12
    1.3.4 内生生物菌肥  12
    1.3.5 化学农药植物内生降解菌剂  12
    1.3.6 功能内生细菌资源库的构建  12-13
  1.4 枯草芽孢杆菌作为生防菌的研究进展  13-14
  1.5 抗菌蛋白的研究进展  14
  1.6 本研究的意义  14-15
第二章 地肤内生拮抗细菌的分离筛选  15-24
  2.1 材料  15
    2.1.1 供试植物、供试菌株和培养基  15
    2.1.2 供试病原真菌  15
    2.1.3 培养基  15
  2.2 方法  15-17
    2.2.1 内生细菌的分离  15-16
    2.2.2 平板对峙法筛选拮抗细菌  16
    2.2.3 D-29菌株抑菌谱测定  16
    2.2.4 D-29菌株的生防效果的测定  16-17
  2.3 结果与分析  17-22
    2.3.1 地肤内生细菌的分离结果  17
    2.3.2 平板对峙法筛选地肤拮抗细菌  17-19
    2.3.3 D-29菌株抑菌谱测定结果  19-20
    2.3.4 D-29菌株的生防效果测定结果  20-22
  2.4 讨论  22-24
第三章 地肤内生细菌D-29菌株的鉴定  24-31
  3.1 材料与方法  24-25
    3.1.1 菌种  24
    3.1.2 培养基  24
    3.1.3 生理生化鉴定培养基  24-25
  3.2 鉴定方法  25-28
    3.2.1 形态鉴定  25
    3.2.2 生理生化鉴定  25-27
    3.2.3 脂肪酸鉴定方法  27-28
  3.3 结果与分析  28-29
    3.3.1 菌落形态  28
    3.3.2 菌体形态  28
    3.3.3 生理生化特征  28-29
    3.3.4 D-29菌株脂肪酸鉴定结果  29
  3.4 结论与分析  29-31
第四章 地肤内生细菌D-29菌株培养条件的优化  31-37
  4.1 材料  31
    4.1.1 供试菌株和病原菌  31
    4.1.2 培养基  31
  4.2 方法  31-32
    4.2.1 种子液制备  31
    4.2.2 菌量测定  31
    4.2.3 D-29菌株抑菌活性测定  31-32
    4.2.4 培养条件的优化  32
  4.3 结果与分析  32-35
    4.3.1 初始发酵培养基筛选结果  32
    4.3.2 培养液的初始pH优化结果  32-33
    4.3.3 培养液的接菌量优化结果  33
    4.3.4 培养液的装液量优化结果  33-34
    4.3.5 培养液的时间优化结果  34
    4.3.6 培养液的转速优化结果  34-35
    4.3.7 培养液的温度优化结果  35
  4.4 讨论  35-37
第五章 枯草芽孢杆菌D-29抗菌蛋白的提取与分离  37-46
  5.1 材料  37
    5.1.1 菌种  37
    5.1.2 培养基  37
    5.1.3 溶液与试剂  37
    5.1.4 主要仪器  37
  5.2 方法  37-40
    5.2.1 D-29菌株抑菌机理及抑菌物质特性研究  37-38
    5.2.2 D-29菌株抑菌蛋白提取与抑菌活性测定  38
    5.2.3 D-29蛋白粗提液的稳定性测定  38
    5.2.4 Barfford法测蛋白浓度  38-39
    5.2.5 浓缩  39
    5.2.6 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析  39-40
  5.3 结果与分析  40-44
    5.3.1 D-29菌株抑菌机理及抑菌物质特性研究结果  40-41
    5.3.2 D-29菌株抑菌蛋白硫酸铵分级沉淀结果  41-42
    5.3.3 D-29蛋白粗提液的稳定性测定结果  42-43
    5.3.4 蛋白标准曲线测定结果  43
    5.3.5 DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析结果  43-44
  5.4 讨论  44-46
第六章 结论  46-48
参考文献  48-53
Abstract  53-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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