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MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的生理功能

作　者: 李国鹏
导　师: 魏华
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 斑马鱼卵母细胞石蜡切片免疫组化
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

MAPK是一类广泛存在于真核细胞中的Ser/Thr蛋白激酶,参与调节各种生理活动。该酶家族分为三类,胞外信号调节酶(the extracellular signal regulated kinase ,ERK), c-jun氨基末端激酶(the c-Jun NH terminal kinase, JNK)和p38 MAPK。其中ERK又包含多种蛋白家族成员,研究最多的是ERK1和ERK2,通常MAPK就是指ERK1和ERK2。近期研究表明,MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。本文首先以不同激素对斑马鱼卵母细胞进行成熟诱导培养,研究激素对卵母细胞成熟的促进作用,选择合适卵母细胞体外培养体系;其次用17α,20β双羟孕酮(17α,20β-DHP)和FSH诱发以GVBD(germinal vesicle breakdown,GVBD)为标志的卵母细胞成熟,利用Western Blot检测MAPK(p-MAPK)在斑马鱼卵母细胞发生GVBD中的表达量,研究MAPK对斑马鱼卵母细胞的成熟调节作用;最后在改进石蜡切片的基础上,通过免疫组化技术,检测MAPK在卵母细胞GVBD产生时的时空分布和位移,并探讨了这个时空分布的生理意义。第一部分,建立了斑马鱼卵母细胞体外培养体系。比较了17α,20β-DHP和FSH体外诱发斑马鱼卵母细胞成熟作用。结果表明:①1U/mL FSH对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在FSH作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了11.98%、16.67%、6.31%、14.25%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了26.11%、29.2%、23.12%、28.73%。②5 ng/mL l7α,20β-DHP的对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在l7α,20β-DHP作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了17.84%、44.67%、27.62%、23.03%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了15.19%、46.82%、32.38%、27.4%。结果表明,FSH和l7α,20β-DHP对卵母细胞都有明显的的促进作用,其中l7α,20β-DHP促进作用显著好于FSH。第二部分,MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用。在第一部分实验的基础上,用5 ng/mL l7α,20β-DHP诱导卵母细胞成熟,通过Western Bolt技术检测MAPK的表达。结果表明:在GVBD之前,MAPK被激活,MAPK活性越大,GVBD%越高。对照组中4h的时候才可以检测到MAPK活性,而且从4h-8h之间MAPK活性变化不大,GVBD%增长缓慢。实验组中卵母细胞在培养2 h后可以检测到激活的MAPK (pMAPK),随着时间推移pMAPK表达逐渐增多,6 h时pMAPK表达量达到最大。随着MAPK激活,卵母细胞发生GVBD,完成第一次减数分裂。最后添加10μg/mL U0126,抑制MAPK表达后,卵母细胞GVBD率明显降低。结果显示MAPK在卵母细胞的第一次减数分裂恢复中有重要促进作用。第三部分,斑马鱼卵母细胞GVBD过程中,MAPK时空分布。首先对卵母细胞石蜡切片制作过程技术了优化。对脱水、透明环节的时间进行了摸索、改进。制作的卵巢组织石蜡切片不易碎,镜下观察组织结构清晰,能清楚地观察到斑马鱼卵巢的I期、II期、III期、IV期、V卵母细胞,卵巢中的卵黄颗粒等细胞卵泡结构,能够满足切片要求和后续实验要求。然后通过免疫组化技术检测了在不同时期激活的MAPK在卵母细胞中的分布,结果表明:I期MAPK没有被激活;在II期时,活化的MAPK开始在细胞质中表达;在III、IV的时候,活化的MAPK表达量增多;卵母细胞在V期时已经发生GVBD,此时在细胞质和核区均可观察到激活的MAPK。实验结果表明FSH激活l7α,20β-DHP的表达,进而磷酸化MAPK,使细胞质中的MAPK激活,然后活性MAPK从细胞质向细胞核转移,从而其他蛋白的活性,促进斑马鱼卵母细胞发生GVBD和调节其他一些生理过程。所以MAPK在其第一次减数分裂过程中起到重要的作用。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章文献综述  12-23
  1.1 卵母细胞发育周期  12
  1.2 卵泡的发育  12-13
    1.2.1 卵泡的发育过程  12-13
    1.2.2 卵泡细胞在卵母细胞发生中的作用  13
  1.3 卵母细胞成熟  13-15
    1.3.1 细胞核成熟  13-14
    1.3.2 细胞质成熟  14-15
  1.4 MAPK  15-18
    1.4.1 MAPK 在成熟分裂起始阶段的多用  16-17
    1.4.2 MAPK 在卵母细胞GVBD 后继事件中的作用  17
    1.4.3 MAPK 在MII 期停滞中的作用  17-18
  1.5 卵母细胞成熟过程中的其他调控因子  18-23
    1.5.1 MPF  18-19
    1.5.2 Mos  19
    1.5.3 促性腺激素  19-20
    1.5.4 cAMP/PKA  20-21
    1.5.5 PKC  21
    1.5.6 细胞生长因子  21-22
    1.5.7 Ca2+  22-23
第二章 17α,20β-DHP 和FSH 对斑马鱼卵母细胞的成熟诱导  23-34
  2.1 实验材料  24-26
    2.1.1 实验对象  24
    2.1.2 仪器与药品  24
    2.1.3 试剂配制  24-26
  2.2 实验方法与数据处理  26-27
    2.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取  26
    2.2.2 离体斑马鱼卵母细胞的体外培养  26-27
    2.2.3 数据处理  27
  2.3 结果  27-31
    2.3.1 FSH 对卵母细胞GVBD 的影响  27-29
    2.3.2 17α,20β-DHP 对斑马鱼卵母细胞GVBD 的影响  29-31
  2.4 讨论  31-34
第三章 MAPK 在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用  34-49
  3.1 实验材料  36-41
    3.1.1 实验对象  36
    3.1.2 仪器与药品  36
    3.1.3 试剂配制  36-41
  3.2 实验方法  41-44
    3.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取  41
    3.2.2 离体斑马鱼卵母细胞的体外培养  41-42
    3.2.3 获取样品  42
    3.2.4 样品前处理  42
    3.2.5 SDS-PAGE 电泳  42
    3.2.6 电泳、转膜  42-43
    3.2.7 封闭  43
    3.2.8 抗体孵育  43-44
    3.2.9 荧光、拍照、显影和定影  44
    3.2.10 结果分析  44
  3.3 结果  44-47
    3.3.1 17α，20β-DHP 的促进作用  44-45
    3.3.2 U0126 对MAPK 的抑制作用以及GVBD 的影响  45-47
  3.4 讨论  47-49
第四章 MAPK 在斑马鱼第一次减数分裂恢复中的定位  49-64
  4.1 实验材料  50-53
    4.1.1 实验对象  50-51
    4.1.2 仪器与药品  51
    4.1.3 试剂配制  51-53
  4.2 实验方法  53-56
    4.2.1 离体斑马鱼卵母细胞的获取  53
    4.2.2 石蜡切片  53-54
    4.2.3 染色步骤  54-56
    4.2.4 免疫组化  56
  4.3 斑马鱼卵母细胞分期标准  56-57
  4.4 结果  57-60
    4.4.1 石蜡切片  57-58
    4.4.2 MAPK 在卵母细胞中的定位  58-60
  4.5 讨论  60-64
    4.5.1 石蜡切片  60-62
    4.5.2 MAPK 在卵母细胞中的定位  62-64
小结  64-65
参考文献  65-75
致谢  75

MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的生理功能

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