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羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株bp26基因突变株的构建及其免疫原性研究

作　者: 李臻
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 布鲁氏菌 bp26基因免疫原性鉴别诊断
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌,由其引发的布鲁氏菌病是一种在世界范围内广泛存在并传播的、以流产和发热为特征的人畜共患传染病。该病对人、畜危害极大,近年呈现出回升的势头。“检、杀、免”是当前防控、消灭动物布鲁氏菌病的主要手段。我国自主研制的羊型M5-90疫苗因其免疫效果好,可有效预防绵羊和山羊布鲁氏菌病。但是该疫苗毒力较强,可造成部分怀孕母畜流产,同时无法区分疫苗免疫和自然感染,从而限制了其在实际中的应用。因此研制一种毒力较弱、具有较好免疫原性,并能进行鉴别诊断的新型疫苗势在必行。本研究以羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株为模板,克隆编码bp26部分功能区域序列EP261, EP262的上下游侧翼序列,采用融合PCR方法将上下游臂融合,连接T载体测序后,双酶切并与自杀载体pGEM-7Zf连接;将克隆的枯草芽孢杆菌SacB基因连接至pGEM-7Zf-bp261、pGEM-7Zf-bp262,然后将构建好的同源重组质粒电转化至布鲁氏菌感受态细胞中,通过同源重组的方法获得基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262；对获得的基因突变株进行PCR鉴定和稳定性检测；用布鲁氏菌M5-90疫苗株、M5-90△bp261和M5-90△bp262突变株分别免疫SPF级BALB/c小鼠,通过虎红平板凝集试验和试管凝集试验初步验证小鼠体内的抗体水平,采用间接ELISA的方法测定小鼠体内总IgG水平以及细胞因予IFN-γ的水平；流式细胞术检测小鼠CD4+和CD8+T细胞的含量；采用脾脏指数法确定基因突变株与亲本株之间的毒力差异；攻毒试验检测各菌株的保扩力；PCR扩增bp26基因中55-152段(BP261)及22-185段(BP262)氨基酸区域,将测序正确的基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a上,再转化到大肠杆菌DE3(BL21)中诱导表达,以纯化的BP261,BP262蛋白作为抗原,与突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。本研究主要获得如下结果：1.成功获得基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262,在15代内未发生回复突变,革兰氏染色显示突变株生理特征末发生改变,具有良好的遗传稳定性。2.免疫原性研究结果显示两基因突变株均可诱导机体产生与亲本株接近甚至略高于亲本株的抗体水平,同时可诱导机体产生特异性的细胞免疫应答。3.毒力试验结果表明两基因突变株毒力均减弱,M5-90Δbp262的毒力下降显著。4.攻毒试验结果显示突变株M5-90Δbp261、M5-90Δbp262在保护机体抵御16M感染方面的能力与亲本株M5-90相当。5.纯化得到可以高效表达的BP261和BP262蛋白。6. Western Blot分析显示表达的BP261和BP262在与免疫小鼠血清进行反应时,与M5-90免疫的阳性血清出现了条带,而与突变株免疫小鼠血.清均未出现条带,因此可作为突变株配套使用的检测蛋白,用御布鲁氏菌M5-90基因缺失株与布鲁氏菌病自然感染的鉴别诊断。以上结果表明构建的布鲁氏菌基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262具有良好的疫苗应用前景,同时也为建立用于鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-12
英文缩略词表  12-13
前言  13-14
第一篇文献综述  14-28
  1 传统型布鲁氏菌病疫苗  15-17
    1.1 S19号弱毒活菌苗  15-17
      1.2 RB51疫苗株  15
      1.3 牛种布鲁氏菌株45/20  15-16
      1.4 羊种布鲁氏菌Rev.l弱毒活苗株  16
      1.5 羊种布鲁氏菌53H38疫苗株  16
      1.6 羊种布鲁氏菌5号弱毒活苗株  16
      1.7 S2号弱毒活苗株  16-17
  2 新型布鲁氏菌疫苗的发展  17-19
    2.1 布鲁氏菌重组蛋白和DNA疫苗  17-18
    2.2 布鲁氏菌基因敲除疫苗  18-19
  3 基于抗原表位的亚单位疫苗研究现状  19-22
    3.1 抗原表位的预测  19-20
    3.2 布鲁氏菌相关抗原表位研究现状  20-21
    3.3 其他抗原表位亚单位疫苗  21-22
  4 展望  22
  参考文献  22-28
第二篇试验研究  28-72
  第一章羊种布鲁氏菌M5-90△bp261、M5-90△bp262的构建及稳定性检测  28-45
    1 材料与方法  29-35
      1.1 材料  29
      1.2 方法  29-35
    2 结果  35-43
      2.1 突变区域选择  35
      2.2 扩增bp261基因上游同源臂与下游同源臂  35-36
      2.3 扩增bp262基因上游同源臂与下游同源臂  36-37
      2.4 扩增sacB基因  37
      2.5 bp261基因上、下游同源臂融合  37-38
      2.6 bp262基因上、下游同源臂融合  38
      2.7 酶切鉴定重组质粒pMD18-bp261/bp262和pGEM-7Zf-bp261/bp262  38-39
      2.8 酶切鉴定同源重组自杀质粒pGEM-7Zf-bp261/bp262-sacB  39-40
      2.9 一次重组菌的筛选  40-41
      2.10 二次重组菌的筛选  41
      2.11 基因突变株的遗传稳定性检测  41-43
    3 讨论  43-44
    4 小结  44-45
  第二章基因突变株免疫原性及毒力状况研究  45-60
    1 材料与方法  45-48
      1.1 材料  45-46
      1.2 方法  46-48
    2 结果  48-57
      2.1 试管凝集试验  48-49
      2.2 虎红平板凝集试验  49
      2.3 小鼠IgG抗体水平检测  49-50
      2.4 细胞因子检测  50
      2.5 小鼠外周血T淋巴细胞亚群分类  50-54
      2.6 脾脏指数法测定细菌毒力  54-56
      2.7 攻毒保护力的初步评价  56-57
    3 讨论  57-59
    4 小结  59-60
  第三章原核表达载体pET-32a-BP261,pET-32a-BP262的构建与表达  60-69
    1 材料与方法  60-64
      1.1 材料  60-61
      1.2 方法  61-64
    2 结果  64-68
      2.1 目的基因的克隆  64-65
      2.2 重组质粒的鉴定  65
      2.3 BP261和BP262蛋白的表达  65-66
      2.4 BP261和BP262蛋白的纯化  66-67
      2.5 Western Blot验证蛋白的免疫原性  67-68
      2.6 Western Blot验证小鼠免疫血清特异性抗体  68
    3 讨论  68-69
    4 小结  69
  参考文献  69-72
第三篇试验结论  72-73
附录  73-77
  1. 基因突变株M5-90△bp261测序结果  73-74
  2. 基因突变株M5-90△bp262测序结果  74-75
  3. 原核表达BP261测序结果  75-76
  4. 原核表达BP262测序结果  76-77
附录二  77-80
  1. PGEM-7Zf~+载体图谱  77-78
  2. pET-32a载体图谱  78-79
  3. pGB262同源重组自杀载体构建图谱  79-80
致谢  80-81
作者简介  81-82
导师评阅表  82

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株bp26基因突变株的构建及其免疫原性研究

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