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家蝇幼虫提取蛋白的抗病毒及抗肿瘤活性研究

作　者: 芦迪
导　师: 雷朝亮
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫及害虫防治
关键词: 家蝇抗病毒蛋白 PRV病毒 A549肿瘤细胞离子交换色谱层析 MTT法索氏提取
分类号: Q966
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抗病毒蛋白作为一类新型的潜在抗病毒药物,一直是国内外的研究热点,有学者曾报道家蝇体内含有抗病毒活性物质。家蝇(Musca domestica L.),属于昆虫纲(Insecta)、双翅目(Diptera)、环裂亚目(Cyclorrhapha)、蝇科(Muscidae)。本文以家蝇幼虫为材料,提取了蝇蛆蛋白,检测了其抗病毒及抗肿瘤活性,主要研究结果如下：1.通过索氏提取从家蝇幼虫体内得到一种脱脂蛋白,利用伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)为靶标病毒,鸡胚成纤维细胞(CEF)为病毒载体,研究了家蝇幼虫体内粗提脱脂蛋白的抗病毒活性。研究发现,PRV病毒与粗提蛋白(0.1mg/m1)在室温下混合2小时后,滴度从原来的5.62×104(TCID50 m1-1)下降至3.16×104,说明粗提蛋白对PRV病毒存在抑制活性；感染前1小时和感染后1小时加入粗提蛋白测得的病毒滴度分别为3.16×104和1.0×104,表明粗提蛋白可能对病毒的吸附注入阶段敏感。2.研究了粗提蛋白对PRV病毒在CEF细胞上吸附注入阶段的影响作用：在病毒感染前1和2小时加入粗提蛋白,在病毒感染2小时后收集细胞培养瓶上清液,测得病毒滴度分别为5.62×104和2.51×104,上清液中仍然含有大量病毒,表明在病毒感染前加入粗提蛋白,可以影响PRV病毒对CEF细胞的吸附注入作用。3.利用离子交换色谱分离纯化家蝇幼虫粗提蛋白后回收得到2个峰,A1和A2。分别测定各组分的抗病毒活性发现,A2纯化蛋白(0.2mg/m1)在与病毒混合作用后,使病毒的滴度由5.62×104降至3.75×104,A1纯化蛋白对病毒滴度没有影响。4.利用MTT法分别对A1和A2纯化蛋白进行了抗肿瘤A549细胞的活性抑制研究,结果表明A1纯化蛋白对A549细胞没有任何作用,而A2纯化蛋白对A549细胞有明显的抑制作用,且随着A2蛋白浓度提高,抑制率上升,说明A2纯化蛋白是我们需要的目标蛋白。本实验通过对家蝇幼虫抗病毒蛋白的抗PRV病毒和抗A549肿瘤细胞的研究,为昆虫抗病毒活性蛋白的研究提供了试验依据。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
第一章文献综述  10-20
  1 病毒对人类的危害及抗病毒药物的研究现状  10-12
    1.1 病毒的危害  10-11
    1.2 抗病毒药物的研究现状  11-12
  2 天然抗病毒活性物质  12-14
    2.1 抗病毒蛋白  12-13
      2.1.1 美洲商陆蛋白  12-13
      2.1.2 MX蛋白  13
    2.2 其它抗病毒活性物质  13-14
  3 昆虫抗病毒蛋白的研究进展  14-17
    3.1 Melittin  14-15
    3.2 Cecropins  15
    3.3 Alloferons  15
    3.4 N-Myristoylated Peptide  15-16
    3.5 蚕体内抗病毒蛋白  16-17
  4 抗肿瘤活性物质研究的概况  17-18
  5 家蝇活性物质的研究现状  18
  6 研究目的与意义  18-20
第二章家蝇幼虫抗病毒活性蛋白的分离提取及活性检测  20-32
  1 材料与方法  20-25
    1.1 供试材料  20-21
      1.1.1 供试虫源  20
      1.1.2 供试病毒  20
      1.1.3 供试十日龄鸡胚  20
      1.1.4 主要试剂  20-21
      1.1.5 仪器设备  21
    1.2 实验方法  21-25
      1.2.1 家蝇幼虫活性蛋白的提取  21-22
        1.2.1.1 脱脂蝇蛆粉的制备  21-22
        1.2.1.2 蝇蛆蛋白的提取  22
      1.2.2 蝇蛆粗提蛋白对PRV的活性  22-25
        1.2.2.1 鸡胚成纤维细胞的原代培养  22
        1.2.2.2 病毒滴度的测定  22-23
        1.2.2.3 蝇蛆粗蛋白的细胞毒性测定  23
        1.2.2.4 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒直接钝化活性作用  23-24
        1.2.2.5 蝇蛆粗蛋白处理细胞感染最佳条件  24-25
        1.2.2.6 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒吸附阶段影响作用  25
  2 结果分析  25-30
    2.1 家蝇幼虫活性蛋白的抗PRV作用  25-30
      2.1.1 蝇蛆粗蛋白对细胞的毒性作用  25-27
      2.1.2 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒直接钝化作用  27
      2.1.3 蝇蛆粗蛋白处理细胞感染最佳条件  27-28
      2.1.4 蝇蛆粗蛋白对病毒吸附阶段的影响作用  28-30
  3 讨论  30-32
第三章家蝇幼虫抗病毒活性蛋白的纯化及抗肿瘤A549细胞活性检测  32-43
  1 材料与方法  32-36
    1.1 供试材料  32-33
      1.1.1 供试虫源  32
      1.1.2 供试病毒及肿瘤细胞  32
      1.1.3 供试十日龄鸡胚  32
      1.1.4 主要试剂  32-33
      1.1.5 仪器设备  33
    1.2 离子交换色谱DEAE-52柱层析纯化粗提蛋白  33-35
      1.2.1 DEAE-52柱层析材料活化  33-34
      1.2.2 平衡  34
      1.2.3 装柱  34
      1.2.4 上样洗脱  34
      1.2.5 样品浓缩  34-35
    1.3 纯化蛋白抗PRV活性  35
      1.3.1 纯化蛋白对CEF细胞的毒性  35
      1.3.2 纯化蛋白的抗PRV活性  35
    1.4 纯化蛋白对肿瘤细胞A549抑制作用  35-36
      1.4.1 肿瘤细胞A549的传代培养、冻存及复苏  35-36
      1.4.2 纯化蛋白的对肿瘤细胞A549抑制活性  36
  2 结果分析  36-42
    2.1 离子交换色谱DEAE-52柱层析纯化结果图谱  36-37
    2.2 纯化蛋白抗PRV活性  37-38
      2.2.1 纯化蛋白对CEF细胞的毒性  37-38
      2.2.2 纯化蛋白的抗PRV活性  38
    2.3 纯化蛋白对肿瘤细胞A549抑制作用  38-42
  3 讨论  42-43
参考文献  43-48
致谢  48

家蝇幼虫提取蛋白的抗病毒及抗肿瘤活性研究

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