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镉形态分析与微区分布的质谱联用技术方法研究及其在印度芥菜耐镉机制中的应用

作　者: 杨红霞
导　师: 李冰; 詹秀春
学　校: 中国地质科学院
专　业: 地球化学
关键词: 印度芥菜镉形态分析微区分布质谱联用技术
分类号: X173
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

超累积植物筛选是重金属污染土壤植物修复的基础和核心问题,同时也是污染环境植物修复的难点及前沿。明确植物抗重金属的生理和分子机理,从而提高植物在污染环境下的适应范围和生产能力,对于高效利用自然资源和进行污染环境的生物修复均具有重要意义。由于缺乏强有力的分析手段,植物体内重金属的迁移机制,解毒机制尚未得出一致结论。本文在综述超积累植物对镉的耐性机制及其相关研究方法的基础上,选取镉富集植物印度芥菜为研究对象,重点开展镉的形态分析与微区分布方法研究,探讨植物螫合肽和区隔化在超积累植物对镉的耐受机制中的作用。综合运用高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)、超高效液相色谱—电喷雾质谱(UPLC-ESI-MS)和超高效液相色谱—飞行时间质谱(UPLC-QTOFMS)联用技术,建立了镉形态分析方法,重点解决了植物螫合肽(PCn)-Cd的定性分析难题,探讨植物螯合肽的形成机制及在植物体耐受与积累重金属中的作用。同时,借助激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)和透射电镜等手段,分析镉及其它六种元素在印度芥菜体内组织水平以及细胞水平上的分布特征,探讨各类组织/细胞对重金属的区隔化在植物体耐受耐镉机制中的作用。本研究取得的主要研究结果如下：1.通过温室水培试验研究了Cd胁迫时间和胁迫水平对印度芥菜生物量的影响以及Cd在植物体内的分布规律,从生物响应的角度探讨了Cd对印度芥菜的毒性及印度芥菜对Cd的耐性。印度芥菜对Cd的最大耐受量为1.0mg/L,超过此浓度植物的正常生长将受到影响,导致生物量下降。植物受胁迫48小时后出现中毒症状,生物量开始下降。随着胁迫时间和胁迫浓度增加,根、叶、茎中镉的浓度均显著增加,根部镉浓度远远大于茎和叶,茎大于叶。在考虑Cd对植物的危害时,胁迫时间和胁迫浓度两个因素要同时考虑。2.利用UPLC-ESMSMS建立了PCn的分析方法,探讨了PCn稳定性及在耐镉机制中的作用,在Cd的强力诱导下,胁迫合成大量的PCn,从而能螯合更多的Cd,产生较强的耐Cd性。建立了PCn-Cd的UPLC-QTOFMS分析方法,检测出(PC2～PC5)-Cd形态。两种质谱联用技术为PCn-Cd的精确测定提供了强有力的分析工具,解决了由于Cd形态标准物质缺乏造成的SEC-HPLC-ICPMS定性难问题,也为研究PCn与其它金属络合物的分析方法提供了可能。3.建立了SEC-HPLC-ICPMS测定Cd形态分析方法,在叶片和根部均检测到植物螯合肽(PC)3-Cd、植物螯合肽(PC)2-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd,及半胱胺酸-Cd四种形态。在植物不同部位Cd存在形态不同,叶片中主要以GSH-Cd存在,而在根部主要以PC2-Cd为主。Cd形态极不稳定,样品处理采取液氮保护并-70℃保存,样品分析全流程用氮吹防氧化措施。研究结果证明,植物螯合肽的合成机制有两种,一是受Cd胁迫直接产生PCn,二是先形成GSH-Cd而后转化成PCn。4.研究了胁迫浓度和胁迫时间对Cd形态分布的影响。可以推论：植物受Cd胁迫后,先储存在根部。随着胁迫浓度的增大,为了减轻Cd的毒害,先后形成GSH-Cd,PC2-Cd, PC3-Cd,并向叶部转移。同时,叶部受Cd胁迫产生的PCn也会传输到根部,结合更多的Cd,形成PCn-Cd,继续向叶部转移,从而使植物产生很强的Cd耐受性。另外,GSH与PCn结合Cd的能力也存在竞争。随着胁迫时间的增加,根和中GSH-Cd、PC2-Cd、PC3-Cd浓度先迅速增加,而后逐渐降低,96h降至最低。表明在植物耐镉机制中PCn起部分作用,受高浓度Cd胁迫时,其他机制可能会被激发。5.建立了SEC-HPLC-ICP-MS同时测定印度芥菜中Cd、Cu、Zn形态分析的方法,在植物叶片和根部同时检测出三种元素的四种形态。在同一植物的不同部位,叶片中主要以GSH-Cd、Cys-Cu、 Cys-Zn为主,根部以PC2-Cd、PC2-Cu、Cys-Cu和Cys-Zn为主。另外,Cd、Cu、Zn在与谷胱甘肽(GSH)和半胱胺酸(Cys)的结合上有竞争。研究结论为一种植物同时修复Cd、Cu、Zn复合污染提供了可能。6.借助LA-ICP-MS质谱技术对富集型印度芥菜茎、叶、叶柄中Cd、P、3、K、Ca、Cu和Zn七种元素的分布特征进行原位分析。结果表明,在茎、叶柄以及主叶脉等组织中,Cd优先分布于含木质部与韧皮部的维管组织中,表明Cd在运输过程中,不易向其他贮存组织扩散。在植物叶片中,Cd主要分布于含有大型液泡的叶肉细胞中,而在上下表皮中分布较低,表明液泡可能是植物存储镉的主要场所。其他元素与Cd的相关性分析结果表Cd与Ca具有相似的分布规律,可能与二者离子半径相近、化学性质相似有关。而K和Ca、P和S的分布呈显著正相关。说明重金属元素进入植株体内并被其吸收运输过程是伴随着植物对其他元素的吸收,且具有相似的运输机制。7.扫描电镜结果证实胁迫浓度超过lmg/L后,细胞结构发生了变化。同时,细胞壁中镉浓度大于细胞液且远远大于细胞器,证明细胞区隔化在镉的解毒机制中具有重要的作用。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
目录  11-15
第一章绪论  15-31
  第一节镉对植物的危害  15-17
    1.1 镉对植物生长的影响  15-16
    1.2 镉对植物生理活动的影响  16-17
  第二节植物对镉的吸收及耐性机制  17-24
    2.1 植物对镉的吸收及运输  17-19
    2.2 植物耐镉机理  19-24
  第三节镉污染土壤的植物修复  24-25
    3.1 超累积植物的定义  24
    3.2 镉的超累积植物  24-25
    3.3 印度芥菜对镉的累积  25
  第四节镉形态与微区分布分析技术  25-29
    4.1 形态分析技术在耐镉机制中的应用  26-27
    4.2 微区分布分析技术在耐镉机制中的应用  27-29
  第五节论文研究思路  29-31
第二章印度芥菜中镉总量分布规律  31-42
  第一节引言  31
  第二节实验部分  31-33
    2.1 植物预培养与处理  31-32
    2.2 仪器与试剂  32-33
    2.3 样品处理  33
  第二节结果与分析  33-40
    2.1 镉胁迫浓度对生物量的影响  33-34
    2.2 镉胁迫时间对生物量的影响  34-35
    2.3 镉胁迫时间与根叶茎中镉含量的关系  35-36
    2.4 镉胁迫浓度与根叶茎中镉浓度的关系  36-38
    2.5 根际分析  38-40
  第三节讨论  40-42
第三章 SEC-HPLC-ICPMS在印度芥菜中镉形态分析中的应用  42-53
  第一节引言  42
  第二节实验部分  42-44
    2.1 仪器条件  42-43
    2.2 试剂及标准溶液  43-44
    2.3 样品处理  44
  第三节结果与分析  44-51
    3.1 分子量校准  44
    3.2 镉形态分离与检测  44-45
    3.3 植物不同部位镉形态分布规律  45-46
    3.4 镉形态稳定性  46-47
    3.5 胁迫浓度对镉形态影响  47-49
    3.6 胁迫时间对镉形态的影响  49-51
  第四节讨论  51-53
第四章 SEC-HPLC-ICPMS同时测定印度芥菜中镉、铜、锌形态  53-62
  第一节引言  53
  第二节实验部分  53-55
    2.1 仪器和主要试剂  53-54
    2.2 样品处理  54-55
  第三节结果与分析  55-61
    3.1 镉、铜、锌元素形态分离与检测  55-56
    3.2 不同元素形态在植物体内的分布规律  56-58
    3.3 镉胁迫时间对铜形态分布的影响  58-59
    3.4 镉胁迫浓度对铜形态分布的影响  59-61
  第四节讨论  61-62
第五章 UPLC-ESIMSMS及LC-TOFMS在PCn-Cd测定中的应用  62-77
  第一节引言  62-63
  第二节 PCn的UPLC-ESIMSMS检测方法  63-66
    2.1 仪器条件  63-64
    2.2 标准溶液配制  64-65
    2.3 PCn标准线性范围  65-66
  第三节实验部分  66-71
    3.1 样品处理  66
    3.2 PCn标准稳定性  66-67
    3.3 镉胁迫浓度对根中PCn含量的影响  67-71
  第四节 PCn-Cd的UPLC-QTOFMS检测方法  71-74
    4.1 仪器条件  71
    4.2 PCn-Cd系列标准配制  71
    4.3 PCn-Cd系列标准测定  71-74
  第五节讨论  74-77
第六章细胞中镉分布规律  77-84
  第一节引言  77
  第二节实验部分  77-79
    2.1 主要仪器及试剂  77-78
    2.2 植物培养  78
    2.3 细胞分离  78
    2.4 透射电镜切片处理  78-79
  第三节结果与分析  79-82
    3.1 细胞各组分中镉含量分布  79
    3.2 镉胁迫浓度和时间对根和叶片细胞中镉含量的影响  79-80
    3.3 镉胁迫对印度芥菜细胞超微结构的影响  80-82
  第四节讨论  82-84
第七章 LA-ICPMS在镉原位微区分析中的应用  84-96
  第一节引言  84
  第二节实验部分  84-86
    2.1 植物培养  84-85
    2.2 样品处理  85
    2.3 仪器条件与参数  85-86
    2.4 数据处理  86
  第三节结果与分析  86-94
    3.1 镉与其它元素在茎中的分布及相关性  86-89
    3.2 镉与其它元素在叶中的分布及相关性  89-91
    3.3 镉与其它元素在叶柄中的分布及相关性  91-94
  第四节讨论  94-96
第八章结论  96-100
  第一节主要结论  96-98
  第二节创新点  98
  第三节研究展望  98-100
致谢  100-101
参考文献  101-116
攻读博士学位期间主要成果  116-117

镉形态分析与微区分布的质谱联用技术方法研究及其在印度芥菜耐镉机制中的应用

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