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优良黄酒酵母菌株的筛选、鉴定和发酵特性研究

作　者: 杨鲁君
导　师: 蒋予箭; 李余动
学　校: 浙江工商大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 黄酒酵母脉冲场凝胶电泳胁迫耐受性单倍体
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黄酒是我国的传统酿造食品,具有独特的风味、丰富的营养物质及较高的保健功效。它是以谷物为主要原料,利用酒药、麦曲或米曲中所含有的多种微生物的共同作用发酵而成的酿造酒。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为关键微生物对酒精发酵起主导作用。在黄酒生产中,酵母细胞受到各种环境因子的胁迫,如温度、渗透压、pH、乙醇浓度等,当胁迫条件超过细胞的生理极限时,就会抑制细胞生长及酒精发酵效率。因此,选育具备优良抗逆性能的黄酒酵母菌株对黄酒发酵工业至关重要。本研究从黄酒厂提供的麦曲、发酵醪和酒药中分离黄酒相关酵母,得到52株菌株；并利用耐乙醇和耐渗透压实验,初筛选到11株优良菌株；然后,根据黄酒发酵过程中的特点进行第二轮的筛选,采用高糖、高酸环境筛选出4株优良的菌株。接着,通过形态学和生理生化试验,初步表明筛选到的4株菌株属于酿酒酵母；通过ITS序列和脉冲场凝胶电泳分析,结果表明4株菌株的确属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。4株黄酒酵母菌株的发酵试验结果显示,从发酵醪中分离到的菌株F-18和F-19的发酵能力比从酒药中分离到得菌株J-16和J-26的发酵能力强,同时黄酒的品质、色泽等方面也比J-16和J-26突出；比较工厂菌株的发酵结果,F-18菌株在产酒精量上和工厂菌株相差不多,产酒率则高于工厂菌株,而且总酸、氨态氮和非糖固形物也高于工厂菌株,这增加了黄酒的色泽和口感；此外,本实验也获得了低产酒精的酿酒酵母菌株J-16和J-26,为低度黄酒的生产提供了基础。通过F-18菌株的单倍体分离筛选,获得了两株抗性优良的单倍体菌株D-2和D-3。发酵试验结果显示,在相同的发酵条件下,D-2和D-3对糖的利用能力强,产酒精少,产酸较高,高级醇产量高等发酵特点。单倍体菌株为黄酒酵母的遗传育种奠定了基础。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第1章引言  12-23
  1.1 黄酒概况  12-14
    1.1.1 黄酒生产的特点  12-13
    1.1.2 主要技术成就  13-14
  1.2 黄酒酵母研究进展  14-15
  1.3 酵母菌的分类鉴定方法  15-22
    1.3.1 经典分类学方法  15-16
    1.3.2 化学分类学方法  16-17
      1.3.2.1 细胞壁成分的分析  16
      1.3.2.2 同工酶的分析  16-17
      1.3.2.3 辅酶Q的分析  17
    1.3.3 分子分类学方法  17-22
      1.3.3.1 GC比的测定  17-18
      1.3.3.2 26S rDNA D1/D2区域  18
      1.3.3.3 18s rDNA区域  18-19
      1.3.3.4 ITS区间  19
      1.3.3.5 脉冲电泳核型分析  19-20
      1.3.3.6 限制性酶切片段多态性分析  20-21
      1.3.3.7 随机扩增多态性DNA分析  21-22
  1.4 本研究的主要内容  22
  1.5 本研究的目的和意义  22-23
第2章黄酒酵母优良抗逆菌株的筛选与鉴定  23-46
  2.1 实验试剂和仪器  23-25
    2.1.1 实验材料  23-24
    2.1.2 主要试剂  24-25
    2.1.3 主要仪器  25
  2.2 试验方法  25-31
    2.2.1 酵母的分离筛选  25-26
      2.2.1.1 样品的处理  25-26
      2.2.1.2 酵母的分离  26
      2.2.1.3 抗逆酵母菌株的筛选  26
    2.2.2 酵母菌的复筛选  26-27
      2.2.2.1 高糖耐受性  26
      2.2.2.2 乳酸耐受性  26-27
      2.2.2.3 生长曲线的绘制  27
    2.2.3 酵母菌的常规鉴定  27-29
      2.2.3.1 酵母菌的形态学观察  27
      2.2.3.2 糖发酵试验  27
      2.2.3.3 碳源同化试验  27-28
      2.2.3.4 氮源同化试验  28
      2.2.3.5 产类淀粉化合物试验  28
      2.2.3.6 产脂试验  28
      2.2.3.7 无维生素生长试验  28-29
    2.2.4 PCR分子鉴定  29-30
      2.2.4.1 酵母基因组的提取  29-30
      2.2.4.2 PCR扩增  30
      2.2.4.3 分子系统发育分析  30
    2.2.5 脉冲场凝胶电泳  30-31
      2.2.5.1 酵母基因组DNA样品制备  30-31
      2.2.5.2 脉冲场凝胶电泳  31
  2.3 结果与分析  31-45
    2.3.1 分离筛选结果  31-32
    2.3.2 复筛结果  32-38
      2.3.2.1 高糖耐受结果  33-34
      2.3.2.2 乳酸耐受结果  34-35
      2.3.2.3 生长曲线绘制结果  35-38
    2.3.3 常规鉴定结果  38-41
      2.3.3.1 形态学观察结果  38-39
      2.3.3.2 生理生化实验结果  39-41
    2.3.4 PCR鉴定结果  41-44
      2.3.4.1 扩增结果  41-42
      2.3.4.2 Blast搜索结果及进化树的构建  42-44
    2.3.5 脉冲场凝胶电泳结果  44-45
  2.4 本章小结  45-46
第3章黄酒发酵试验  46-53
  3.1 实验试剂和仪器  46-48
    3.1.1 实验材料  46
    3.1.2 主要试剂  46-47
    3.1.3 主要仪器  47-48
  3.2 试验方法  48-49
    3.2.1 黄酒发酵过程  48
    3.2.2 理化指标的测定  48
    3.2.3 高级醇含量的检测方法  48-49
    3.2.4 数据处理  49
  3.3 结果与分析  49-52
  3.4 本章小结  52-53
第4章优良抗逆菌株单倍体的分离筛选及发酵特性的研究  53-65
  4.1 实验试剂和仪器  53-55
    4.1.1 实验材料  53
    4.1.2 主要试剂  53-54
    4.1.3 主要仪器  54-55
  4.2 试验方法  55-58
    4.2.1 黄酒酵母单倍体的分离和鉴定  55-56
      4.2.1.1 酵母的活化  55
      4.2.1.2 诱导孢子的形成  55
      4.2.1.3 单倍体的分离和获得  55-56
      4.2.1.4 单倍体的鉴定  56
    4.2.2 黄酒酵母单倍体抗性筛选  56-57
      4.2.2.1 乙醇耐受性  56
      4.2.2.2 渗透压耐受性  56
      4.2.2.3 高糖耐受性  56
      4.2.2.4 乳酸耐受性  56-57
    4.2.3 黄酒酵母单倍体的黄酒发酵试验  57
      4.2.3.1 黄酒发酵过程  57
      4.2.3.2 理化指标的测定  57
      4.2.3.3 高级醇含量的检测方法  57
    4.2.4 数据处理  57-58
  4.3 结果与分析  58-64
    4.3.1 黄酒酵母单倍体的分离与鉴定结果  58
    4.3.2 黄酒酵母单倍体的抗性筛选结果  58-61
      4.3.2.1 乙醇和渗透压耐受结果  58-59
      4.3.2.2 高糖耐受结果  59-60
      4.3.2.3 乳酸耐受结果  60-61
    4.3.3 发酵试验结果  61-64
  4.4 本章小结  64-65
第5章结论与存在的问题  65-67
  5.1 结论  65
  5.2 存在的问题  65-67
参考文献  67-73
附录  73-74
  附件1 脉冲细胞破壁添加关系对照表  73-74
研究生期间发表的论文  74-75
致谢  75-76

优良黄酒酵母菌株的筛选、鉴定和发酵特性研究

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