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蚕蛹活性多肽的制备及降血压、降血糖活性研究

作　者: 张海娜
导　师: 李竞
学　校: 西南大学
专　业: 药物分析学
关键词: 蚕蛹活性多肽双酶解葡聚糖凝胶半制备HPLC 分离纯化体内降血压体内降血糖
分类号: R943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蚕蛹(silkworm pupae),是家蚕上蔟结茧后4天左右所形成的产物,是缫丝工业的副产品。我国是养蚕大国,蚕蛹产量很大,但由于缺乏深加工技术,基本上都被用作饲料,资源利用率低。但是,干蚕蛹的营养却很丰富,其中粗蛋白质含量高达50%,油脂含量高达25%-30%,还含有多种维生素,微量元素以及甲壳素、抗菌肽、多糖等,是“作为普通食品管理的新资源名单”中唯一上榜的昆虫类。因此,加大对蚕蛹的开发力度具有重要的意义和广阔的前景。“三高症”是指高血压、高血糖(即糖尿病)和高脂血症。它们是现代社会派生出来的“富贵病”,或单独存在,或相互关联。譬如：糖尿病人很容易同时患上高血压或高血脂症,而高血脂又是动脉硬化形成和发展的主要因素,动脉硬化患者血管弹性差加剧血压升高。所以,当出现这三种病症中的任何一种,后期都易形成“三高症”。高血压和高血糖的危险性不可小觑,目前临床常用的降血压药物有很多种,它们治疗高血压的效果十分显著,但是长期服用易引起皮疹、泌尿系统病变等副作用；而糖尿病治疗的化学类药物也存在毒副作用大这一难题。基于市场对安全、方便、有效的降血压、降血糖药物的迫切需要,人们便把目光投向了天然降血压、降血糖物质。本文的研究工作主要侧重于蚕蛹蛋白活性多肽的制备和它在动物体内的活性探究。首先选择适合的蛋白酶对经过脱脂处理的蚕蛹蛋白进行双酶解,先进行单因素实验,再通过设计响应面优化实验,随后采用大孔树脂、葡聚糖凝胶、半制备液相色谱技术对蚕蛹活性多肽进行分离纯化,最后在动物体内进行活性测定,有望进一步开发成降血压、降血糖药物或者功能性保健品。这样一来,既能避免蚕蛹作为缫丝副产品的资源浪费,也能促进对蚕蛹蛋白资源的进一步利用。本文由国家桑蚕产业技术体系“蚕桑大宗资源深度利用关键技术与产业化规范”项目提供资金支持,是该项目的部分研究内容,主要研究结果如下：(1)蛋白酶水解选择及优化实验本实验选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶5种蛋白酶对脱脂处理后的蚕蛹蛋白进行双酶解效果实验,以水解度(DH)和血管紧张素酶(ACE)抑制率作为考察指标,最终得到的结果是,以碱性蛋白酶和复合性蛋白酶双酶解制备出的蚕蛹活性多肽ACE抑制率最高,达到38.09%。在响应面优化实验之前进行了酶解时间、pH、底物浓度、加酶量、反应温度这五个因素的单因素实验,在此基础上再进行响应面优化实验,最终得到最佳的酶解条件为：酶解时间3.5h,底物浓度10.12%,温度50.22℃,pH8.5,加酶量7.03%。(2)大孔树脂、葡聚糖凝胶及半制备RP-HPLC纯化分离纯化蚕蛹活性多肽的实验本实验选择大孔树脂DA201-C首先进行脱色脱盐处理,上样流速为0.5ml/min,洗脱剂为75%的乙醇,洗脱流速为2.0ml/min。将大孔树脂分离得到的解析液,再经过Sephadex G-25和Sephadex LH-20纯化,出现5个峰,其ACE抑制率分别为：P1-24.82%,P2-22.37%,P3-32.64%,P4-34.82%,P5-44.37%,因此选择P5进行下一步实验。将峰P5的组分进行半制备HPLC分析,取色谱图中分离较好的几个组分,测定其ACE抑制率,并用SDS-PAGE电泳法测其分子量范围。(3)蚕蛹活性多肽的体内降血压活性探究本实验选择自发性高血压模型大鼠为实验动物,采取卡托普利为对照药物,将葡聚糖凝胶纯化后的多肽液冷冻干燥后按一定剂量进行一次性和长期给药,实验结果表明,实验所提取的蚕蛹多肽降血压活性与卡托普利活性相当；降血压的持续效果较卡托普利稍弱。(4)蚕蛹活性多肽的体内降血糖活性探究本实验选择四氧嘧啶引起的高血糖模型小鼠为实验动物,采取盐酸二甲双胍为对照药物,将葡聚糖凝胶纯化后的多肽液冷冻干燥后按一定剂量进行一次性和长期给药,实验结果表明,实验所提取的蚕蛹多肽还有一定的降血糖活性,但活性不及盐酸二甲双胍,且对高血糖模型小鼠有提高免疫力的作用。

全文目录

目录  3-5
摘要  5-7
Abstract  7-10
第一章文献综述  10-20
  1.1 蚕蛹概况  10-11
  1.2 高血压、高血糖概况  11-12
    1.2.1 高血压现状  11-12
    1.2.2 糖尿病现状  12
  1.3 蚕蛹活性多肽生理功能的研究进展  12-14
    1.3.1 ACE对血压的调节作用  12-13
    1.3.2 蚕蛹活性多肽的降血压、降血糖研究  13
    1.3.3 蚕蛹活性多肽的其他功能研究  13-14
  1.4 活性多肽的提取、分离纯化及分析方法  14-18
    1.4.1 活性多肽的制备方法  14-15
    1.4.2 活性多肽的分离纯化方法  15-16
    1.4.3 活性多肽的分析鉴定  16-17
    1.4.4 活性多肽的体内分析方法  17-18
  1.5 立题背景  18
  1.6 主要研究内容  18-20
第二章双酶解法制备蚕蛹蛋白活性多肽的方法研究  20-36
  2.1 引言  20
  2.2 材料与仪器  20-21
    2.2.1 试剂  20
    2.2.2 仪器  20-21
  2.3 实验方法  21-24
    2.3.1 蛋白酶的选择实验  21
    2.3.2 碱性蛋白酶与复合蛋白酶双酶水解蚕蛹蛋白的单因素实验  21-22
    2.3.3 分析测定方法  22-24
  2.4 数据处理方法  24
  2.5 结果与分析  24-34
    2.5.1 蚕蛹蛋白双酶水解的单因素实验结果  24-29
    2.5.2 响应面实验优化蚕蛹蛋白的酶解工艺条件  29-34
  2.6 讨论  34
  2.7 本章小结  34-36
第三章大孔树脂、葡聚糖凝胶及半制备型高效液相色谱分离纯化蚕蛹活性肽  36-44
  3.0 引言  36
  3.1 材料与方法  36-38
    3.1.1 实验材料  36
    3.1.2 仪器  36-37
    3.1.3 实验方法  37-38
  3.2 结果与分析  38-41
    3.2.1 大孔树脂对蚕蛹蛋白酶解液的分离纯化实验  38-39
    3.2.2 凝胶过滤色谱对大孔树脂解析液的分离纯化实验  39-40
    3.2.3 半制备HPLC分离纯化蚕蛹活性多肽P_5  40-41
  3.3 讨论  41-42
  3.4 本章小结  42-44
第四章蚕蛹蛋白活性多肽的电泳分离及分子量鉴定  44-50
  4.1 引言  44
  4.2 试剂与仪器  44-47
    4.2.1 试剂  44
    4.2.2 仪器  44
    4.2.3 Tricine-SDS-PAGE电泳  44-47
  4.3 Tricine-SDS-PAGE电泳法初步鉴定蚕蛹活性多肽的分子量  47-48
  4.4 讨论  48
  4.5 本章小结  48-50
第五章蚕蛹活性多肽在SHR体内的降血压活性探究  50-56
  5.1 引言  50
  5.2 材料和方法  50-52
    5.2.1 试剂  50
    5.2.2 仪器  50-51
    5.2.3 蚕蛹活性多肽的体内降血压预实验  51
    5.2.4 蚕蛹活性多肽的一次性给药实验  51
    5.2.5 蚕蛹活性多肽的长期给药实验  51
    5.2.6 统计分析  51-52
  5.3 结果与分析  52-55
    5.3.1 一次性给药后蚕蛹活性多肽对SHR和SD大鼠血压的影响  52-53
    5.3.2 长期给药后蚕蛹活性多肽对SHR和SD大鼠血压的影响  53
    5.3.3 长期给药后蚕蛹活性多肽对SHR和SD大鼠体重的影响  53-55
  5.4 讨论  55
  5.5 本章小结  55-56
第六章蚕蛹活性多肽对四氧嘧啶致高血糖小鼠的降血糖实验  56-62
  6.1 引言  56
  6.2 材料和方法  56-57
    6.2.1 材料  56
    6.2.2 模型建立方法  56-57
    6.2.3 蚕蛹活性多肽对糖尿病小鼠空腹血糖的影响  57
    6.2.4 21d后蚕蛹活性多肽对各组小鼠的影响  57
    6.2.5 数据处理  57
  6.3 结果与分析  57-60
    6.3.1 蚕蛹活性多肽对糖尿病小鼠空腹血糖的影响  57-58
    6.3.2 21天后蚕蛹活性多肽对各组小鼠体重的影响  58-59
    6.3.3 21天后蚕蛹活性多肽对高血糖模型小鼠的免疫器官的影响  59-60
  6.4 讨论  60
  6.5 本章小结  60-62
参考文献  62-68
致谢  68-70
在校期间发表的论文  70

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