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斑马鱼补体调节因子RCA group2基因簇与CD59基因的鉴定、表达和功能研究

作　者: 吴杰
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 斑马鱼补体 RCAgroup2基因簇 CD59
分类号: Q953
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

补体是先天性免疫系统重要的组成部分，它的激活受体内一系列补体调节因子精密的调控，以防补体的过度激活对机体细胞造成损伤，同时也避免补体成分的浪费。补体的调控主要集中在C3转化酶的形成、稳定和攻膜复合体形成的关键步骤上。在人中，调节C3转化酶的补体调节因子的基因都紧密连锁在1号染色体的长臂上(1q32)，称为补体激活调节因子RCA基因簇，这个基因簇可以分为group1和group2；而调节攻膜复合体形成的关键补体调节因子是CD59。最近在斑马鱼中已经有RCAgroup1基因簇的相关报道，而其他的补体调节因子尚无报道。为了完善对斑马鱼补体调节机制的了解，本文对斑马鱼RCAgroup2基因簇和CD59基因开展了研究。我们发现并克隆出了RCAgroup2基因簇的两个基因（ZRC1和ZRC2）和CD59基因，它们具有与高等动物相关基因相似的基因和蛋白特征，且它们呈母源性表达，尤其是ZRC1，可能在胚胎发育的早期通过母源传递来起保护作用。斑马鱼RCAgroup2基因簇的两个基因ZRC1和ZRC2相邻，并与PFKFB1基因紧密连锁，而位于PFKFB2基因下游17Mkb处，这与蛙、鸡和人的RCAgroup2基因簇稍有不同。但是，RCA group2基因相对于PFKFB2基因的方向和斑马鱼RCA group2基因编码蛋白的顺序与蛙，鸡和人的相一致。ZRC1和ZRC2彼此之间具有71.1%的一致性，说明它们是在鱼类从与哺乳动物共同的祖先中分化出来之后通过基因复制产生的。ZRC1和ZRC2分别编码一个I型膜蛋白和可溶性蛋白，两者具有不同的表达谱，这说明它们可能已经发生了功能性的分化。此外，LPS能够显著的上调ZRC2基因的表达，说明ZRC2可能与急性时相反应有关。斑马鱼CD59基因所编码的蛋白由N-端25个氨基酸组成的信号肽、C-端21个氨基酸组成的GPI锚定区域和中间的LU结构域组成。成熟的斑马鱼CD59蛋白具有保守的10个半胱氨酸残基，使得斑马鱼CD59具有与人CD59相似的三维结构，对功能的发挥非常重要。唯一与哺乳动物不同的是斑马鱼CD59它没有N-糖基化位点，这与其他鱼类CD59情况一致，推测N-糖基化修饰对硬骨鱼CD59功能的发挥可能并非必须的。直线同源分析显示斑马鱼CD59基因与FBXO3基因紧密连锁，且细胞定位分析显示斑马鱼CD59基因编码的蛋白主要以膜蛋白的形式在细胞膜上表达，这些都与其他高等物种相似。不过与高等动物不同的是，斑马鱼CD59在mRNA水平和蛋白水平在脑中表达量都异常的高。我们还发现体外表达的斑马鱼CD59能够识别细菌并在浓度高时具有一定的杀菌作用，表明除了具有经典的补体调节功能外，CD59可能还可以通过对病原菌的识别及直接杀菌作用而对鱼类重要的器官脑的保护起重要作用。总而言之，本文第一次报道了斑马鱼RCA group2基因簇和终末裂解途径的补体调节蛋白的存在，表明鱼类具有一套较为完整的补体调节系统，为人们理解低等物种的防御机制提供了新的信息。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-33
  1 免疫学研究的新模式生物-斑马鱼  14-15
    1.1 斑马鱼基本特征  14
    1.2 斑马鱼与免疫学研究  14-15
  2 补体系统概述  15-20
    2.1 补体的定义与发现  15-16
    2.2 补体系统的命名  16
    2.3 脊椎动物补体系统概述  16-20
  3 RCA 的研究概况  20-25
    3.1 RCA 蛋白的结构域特征  21
    3.2 RCA 蛋白特征  21-24
    3.3 RCA 蛋白的补体调节机制  24
    3.4 RCA 在各物种中的研究进展  24-25
  4 补体调节蛋白 CD59 的研究概况  25-30
    4.1 CD59 的发现  25-26
    4.2 CD59 的蛋白特征  26-27
    4.3 CD59 与 Ly-6 蛋白超家族  27
    4.4 CD59 的功能  27-30
    4.5 CD59 在各物种中的研究进展  30
  5 研究目的与技术路线  30-33
    5.1 研究目的  30-31
    5.2 技术路线  31-33
第二章斑马鱼 RCA group 2 基因簇的鉴定、表达与进化  33-64
  1 前言  33
  2 材料与方法  33-47
    2.1 实验材料  33-35
    2.2 实验方法  35-47
      2.2.1 斑马鱼肝脏总 RNA 的提取与 cDNA 模板的制备  35-38
      2.2.2 斑马鱼 RCA group 2 基因 ZRC1 和 ZRC2 的克隆  38-43
      2.2.3 序列比对与系统进化分析  43-44
      2.2.4 Real-time PCR 技术检测斑马鱼 ZRC1 和 ZRC2 基因表达谱  44-47
  3 结果  47-60
    3.1 斑马鱼 RCA group 2 基因 ZRC1 和 ZRC2 的克隆  47
    3.2 斑马鱼 ZRC1 和 ZRC2 基因的序列分析  47-50
    3.3 ZRC1 和 ZRC2 的基因结构分析  50-51
    3.4 ZRC1 和 ZRC2 的连锁与进化  51-54
    3.5 ZRC1 和 ZRC2 的 SCR 的关系  54-56
    3.6 斑马鱼 ZRC1 和 ZRC2 基因的表达模式  56-60
      3.6.1 ZRCs 在不同组织中的表达  56-57
      3.6.2 ZRCs 在不同发育时期中的表达模式  57-59
      3.6.3 Real-time PCR 技术检测 LPS 和 LTA 处理对斑马鱼 ZRCs 表达的影响  59-60
  4 讨论  60-64
第三章斑马鱼 CD59 基因的鉴定、表达及功能研究  64-116
  1 前言  64
  2 材料与方法  64-93
    2.1 实验材料  64-67
    2.2 实验方法  67-93
      2.2.1 斑马鱼总 RNA 的提取与 cDNA 模板的制备  67
      2.2.2 斑马鱼 CD59 基因开放阅读框的克隆  67-69
      2.2.3 序列比对与系统进化分析  69-70
      2.2.4 Real-time PCR 技术检测斑马鱼 CD59 基因的表达情况  70-73
      2.2.5 斑马鱼 CD59 蛋白的原核重组表达  73-89
      2.2.6 斑马鱼 CD59 蛋白的细胞定位研究  89-90
      2.2.7 重组蛋白 His-CD59 功能研究  90-93
  3 结果  93-112
    3.1 斑马鱼 CD59 基因 ORF 片段的克隆  93-94
    3.2 斑马鱼 CD59 基因的生物信息学分析  94-102
      3.2.1 斑马鱼 CD59 基因及编码蛋白的序列分析  94-97
      3.2.2 斑马鱼 CD59 基因的直线同源分析  97
      3.2.3 斑马鱼 CD59 基因结构分析  97-99
      3.2.4 斑马鱼 CD59 蛋白的氨基酸多序列比对分析  99-101
      3.2.5 斑马鱼 CD59 蛋白的系统进化分析  101-102
    3.3 斑马鱼 CD59 基因的表达模式  102-104
      3.3.1 Real-time PCR 技术检测斑马鱼 CD59 基因在不同组织中的表达模式  102-103
      3.3.2 Real-time PCR 技术检测斑马鱼 CD59 基因在不同发育时期中的表达模式  103-104
    3.4 斑马鱼 CD59 重组蛋白的原核表达  104-109
      3.4.1 重组质粒 pET-28a/CD59 的构建  104-106
      3.4.2 重组 pET-28a/CD59 质粒表达菌种的构建  106
      3.4.3 斑马鱼重组蛋白 His-CD59 在大肠杆菌中融合表达与纯化  106-108
      3.4.4 重组蛋白 His-CD59 的鉴定  108
      3.4.5 重组蛋白 His-CD59 的复性  108-109
    3.5 斑马鱼 CD59 蛋白的细胞定位  109-110
      3.5.1 斑马鱼重组蛋白 His-CD59 制备的多克隆抗体的检测  109
      3.5.2 Weatern blot 技术检测斑马鱼 CD59 蛋白的细胞定位  109-110
    3.6 重组蛋白 His-CD59 功能初探  110-112
      3.6.1 重组蛋白 His-CD59 与细菌的结合  110-111
      3.6.2 重组蛋白 His-CD59 与 LPS/LTA 的结合  111-112
      3.6.3 重组蛋白 His-CD59 的杀菌活性  112
  4 讨论  112-116
结论  116-118
参考文献  118-124
附录  124-127
致谢  127-128
作者简介  128-129
发表的学术论文  129

斑马鱼补体调节因子RCA group2基因簇与CD59基因的鉴定、表达和功能研究

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