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金雀异黄素诱导斑马鱼肝细胞合成VTG的作用机理研究

作　者: 毕帅
导　师: 王蔚；汝少国
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生态学
关键词: 金雀异黄素 斑马鱼 原代肝细胞 雌激素受体 PPAR
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


金雀异黄素(Genistein,4’,5,7-三羟基异黄酮)富集于水体和饵料中,能够显著促进鱼类卵黄原蛋白(VTG)的生成,但其诱导鱼类VTG表达的作用机理还不明确。本文以模式生物斑马鱼(Danio rerio)原代培养肝细胞为实验材料,以特异性拮抗剂阻断雌激素受体(ERs)或其亚型(ERα或ERβ),研究了雌激素受体在金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA合成中的作用;通过检测金雀异黄素对斑马鱼原代肝细胞中ERαmRNA和ERβmRNA表达水平的影响,进一步探讨了金雀异黄素是否通过提高ERs的合成来诱导vtg的转录;并对过氧化物酶体增生物激活受体(PPARs)是否参与金雀异黄素对vtg转录表达的诱导作用进行了初步的研究。研究结果如下:(1) 1~1000μmol/L金雀异黄素可剂量性诱导雄性斑马鱼离体肝细胞合成vtg-1 mRNA,其中1000μmol/L的金雀异黄素诱导作用与1μmol/L的17β-雌二醇(E2)接近,证明了金雀异黄素具有弱雌激素活性,约为E2的千分之一。(2)采用雌激素受体特异性拮抗剂(ICI 182780)与1000μmol/L金雀异黄素联合暴露雄性斑马鱼原代肝细胞48h后,发现vtg-1 mRNA的相对表达量显著下降,金雀异黄素对vtg-1 mRNA的诱导作用被显著抑制,结果证实金雀异黄素是通过雌激素受体途径诱导斑马鱼原代肝细胞产生VTG。(3)采用ERβ的特异性拮抗剂(美服培酮)与1000μmol/L金雀异黄素联合暴露雄性斑马鱼原代肝细胞48 h后,vtg-1 mRNA的表达几乎完全被抑制。ERα的特异性拮抗剂(雷洛昔芬)与1000μmol/L金雀异黄素联合暴露雄性斑马鱼原代肝细胞48 h则对vtg-1 mRNA的转录有部分抑制作用。结果表明金雀异黄素主要通过ERβ介导对斑马鱼肝细胞VTG的诱导作用,ERα也部分参与了对VTG合成的介导作用。(4)进一步研究金雀异黄素对斑马鱼原代肝细胞ERs合成的影响,结果显示1000μmol/L金雀异黄素显著促进了ERαmRNA和ERβmRNA的转录,但ERβ的表达量远高于ERα,约为ERα的1.9倍。说明金雀异黄素可通过诱导ERs的表达来促进VTG的合成,ERβ在其中起主要作用。(5)过氧化物酶体增生物激活受体(PPARs)是金雀异黄素的另一分子靶点。为了研究PPARs是否参与金雀异黄素对VTG的诱导作用,采用PPARs的特异性拮抗剂进行了研究,结果显示斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA的表达无显著变化,初步说明PPARs并不参与金雀异黄素对VTG的诱导作用。综上,本文研究表明金雀异黄素具有弱雌激素活性,金雀异黄素可通过雌激素受体途径直接诱导斑马鱼肝脏细胞产生VTG,其中主要是通过ERβ进行调节,金雀异黄素还通过诱导ERs表达的升高,促进VTG的合成。PPAR并不参与金雀异黄素对VTG的诱导作用。本文初步探明了金雀异黄素诱导斑马鱼离体肝细胞产生VTG的作用机理,为正确评价植物雌激素对鱼类的影响奠定了理论基础。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
0 前言  11-13
1 鱼类细胞在植物雌激素研究中的应用  13-18
  1.1 植物雌激素在水环境和饵料中的含量  13-14
  1.2 植物雌激素对鱼类VTG 的诱导  14-15
  1.3 植物雌激素诱导鱼类产生VTG 的作用机理  15-16
  1.4 鱼类细胞在植物雌激素研究中的应用  16-17
    1.4.1 应用于植物雌激素研究的鱼类细胞系  16-17
    1.4.2 应用于植物雌激素研究的鱼类原代细胞  17
  1.5 展望  17-18
2 金雀异黄素对雄性斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 的诱导  18-29
  2.1 材料与方法  19-25
    2.1.1 实验材料  19
    2.1.2 实验药品与仪器  19-20
    2.1.3 实验方法  20-25
  2.2 结果  25-27
    2.2.1 斑马鱼原代肝细胞培养及细胞计数结果  25-26
    2.2.2 金雀异黄素对雄性斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA表达水平的影响  26-27
  2.3 讨论  27-28
  2.4 小结  28-29
3 ERs 在金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 中的调节作用  29-37
  3.1 材料与方法  29-31
    3.1.1 实验材料  29-30
    3.1.2 药品和试剂  30
    3.1.3 实验仪器设备  30
    3.1.4 实验方法  30-31
  3.2 结果  31-33
    3.2.1 ERs 的特异性拮抗剂处理对金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 的影响  31
    3.2.2 ERα特异性拮抗剂处理对金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 的影响  31-32
    3.2.3 ERβ特异性拮抗剂处理对金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 的影响  32-33
  3.3 讨论  33-35
  3.4 小结  35-37
4 金雀异黄素对斑马鱼原代肝细胞中 ERs 表达的影响  37-42
  4.1 材料与方法  37-39
    4.1.1 实验材料  37
    4.1.2 药品和试剂  37
    4.1.3 实验仪器设备  37-38
    4.1.4 实验方法  38-39
  4.2 结果  39
  4.3 讨论  39-40
  4.4 小结  40-42
5 PPARs 的特异性拮抗剂处理对金雀异黄素诱导斑马鱼原代肝细胞vtg-1 mRNA 的影响  42-47
  5.1 材料与方法  43-44
    5.1.1 实验材料  43
    5.1.2 药品和试剂  43
    5.1.3 实验仪器设备  43
    5.1.4 实验方法  43-44
  5.2 结果  44-45
  5.3 讨论  45-46
  5.4 小结  46-47
6 结论  47-48
参考文献  48-60
致谢  60-61
个人简历  61
发表的学术论文  61

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