学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

瓶霉属Phialophora spp.来源的纤维素酶和半纤维素酶的基因克隆与表达

作　者: 赵军旗
导　师: 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 瓶霉 纤维素酶 半纤维素酶 嗜酸 嗜热 热稳定性 基因克隆与表达 突变
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 306次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


随着化石燃料的短缺和对环境保护的日益重视,人们一直在努力寻找其他替代能源。作为自然界第一大再生资源的木质纤维素,因其可用于生产生物能源,成为了人们研究的热点。在木质纤维素降解过程中,一般先要用稀酸进行热处理来提高转化效率,然后再进行酶降解以获得终产物葡萄糖,所以在生物质转化中嗜热、嗜酸且稳定性好的纤维素降解酶就显得至关重要。本研究从酸性矿液废水中分离到两株可以降解木质纤维素的真菌,G5和P13。通过形态和ITS序列分析鉴定为瓶霉Phialophora。对高产纤维素酶活的菌株G5进行了产酶情况的初步分析,在玉米芯或微晶纤维素作为唯一碳源诱导下,该菌株具有较好的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、p-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的生产能力。所产酶的最适pH在4.0-5.0之间,最适温度除木聚糖酶(50℃)外都高于60℃且在50℃有很好的稳定性。与商业酶Accellerasc1500(Genencor)比较,菌株G5的发酵液对纯纤维素和天然底物的降解能力分别可以达到商业酶的60%和80%。通过简并PCR和TAIL-PCR的方法从菌株G5中克隆到一个第5家族的内切葡聚糖酶编码基因egG5,一个第45家族的内切葡聚糖酶基因egGH45,一个第6家族的外切纤维素酶基因cbh6A,和一个第1家族的葡萄糖苷酶基因bglGH1。这些基因都具有一定的新颖性,其推测氨基酸序列与其它真菌来源的已知蛋白序列一致性为67-85%。经毕赤酵母异源表达纯化后,这些基因重组蛋白的酶学性质得以确定。重组EgG5最适pH为4.0-5.0,最适温度为70℃,在80℃还有70%以上酶活,且具有良好的热稳定性(65℃处理12h剩余52.5%酶活)。EgG5模拟三维结构分析表明其催化位点附近带负电荷且含有特殊的β-折叠片结构,该结构可能与其嗜酸和热稳定性有关。为了验证其功能,构建了两个突变体EgG5-Mut(将β-折叠片突变成环状结构,并以园二色光谱测定二级结构)和EgG5-CBM(去掉CBM区),同时进行表达和性质分析。两个突变体和EgG5有相似的最适pH和温度,但是pH稳定性分别是pH2.0-10.0和pH2.0-7.0。它们的热稳定性改变明显,EgG5-Mut的热稳定性变差,65℃处理12h,剩余13.4%酶活；EgG5-CBM则变得更加稳定,65℃处理12h,剩余94.9%酶活,在80℃处理30min后仍保留15.5%酶活,同时其比活更高(711.6U/mg v.s.60.3U/mg)。重组EgGH45和CBH6A的最适pH分别是6.0和7.0,在pH5.0-8.0和pH5.5-8.0还有80%的相对酶活。最适温度分别是60℃和65℃,在pH2.0-11.0和70℃以下温度稳定(保持80%以上的酶活)。重组BglGH1最适pH5.5-6.0,最适温度50℃,是一个可降解芳香族β-葡萄糖苷和纤维寡糖的广谱葡萄糖苷酶。菌株G5经微晶纤维素诱导后产生了一个酸性β-1,4-葡聚糖酶(BglG5)。纯化的BglG5在pH4.5-5.0和55-60℃条什下酶活最高,甚至在pH1.5-2.0还有很高的降解大麦葡聚糖的活力,且在pH2.0-9.0和55℃以下温度非常稳定,具有很好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力,在模拟胃液条件下稳定。该酶降解的主要产物是葡萄糖和纤维二糖,可以降低饲料和麦芽汁的粘度,以及提高麦芽汁的过滤速率。基于质谱分析获得部分内肽设计简并引物,采用5’-TAIL-PCR和3’-RACE的方法获得BglG5的全长编码基因。BglG5属糖苷水解酶第7家族,其推测氨基酸序列与已知蛋白序列一致性为69%。与瓶霉G5相比,菌株P13具有较强的产半纤维素酶能力。本研究通过基因克隆得到一个第5家族的甘露聚糖酶基因man5AP13和一个第11家族的木聚糖酶基因xyl11A。它们与已知蛋白序列的最高一致性分别为53%和81%。经酵母表达纯化的重组酶MAN5AP13最适pH为1.5,最适温度为60℃,在pH1.0-7.0范围内可以保持70%以上酶活,55℃处理2h还剩余83%酶活,在模拟胃液中可以降解甘露聚糖,并对其嗜酸和酸性条件下稳定的机理进行了分析。重组酶XYL11A最适pH5.0-5.5,最适温度65℃。本文从瓶霉属的两个菌株出发,从瓶霉中获得七个具有一定新颖性的纤维素酶和半纤维素酶,包括耐热的纤维素酶,极端嗜酸的甘露聚糖酶,纯化的酸性β-1,4-葡聚糖酶和广谱的葡萄糖苷酶。在获得新颖基因的同时也尝试了原酶纯化及表达,并为嗜酸、嗜热和酶稳定性机理的研究提供了良好的实验材料。瓶霉G5经适当诱变后可直接用于纤维素酶的生产,从而实现快速,有效,低廉地生物能源的生产。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 绪论  15-30
  1.1 木质纤维素的组成、结构及降解方式  15-16
  1.2 糖苷水解酶  16-18
  1.3 纤维素酶及半纤维素酶的研究进展  18-23
    1.3.1 纤维素酶  18-20
    1.3.2 半纤维素及其降解酶  20-23
    1.3.3 碳水化合物结合结构域(CBD或CBM)的研究进展  23
  1.4 木质素降解酶的研究进展  23-24
  1.5 纤维素酶及半纤维素酶的应用  24-26
    1.5.1 在饲料中的应用  24
    1.5.2 在食品工业中的应用  24-25
    1.5.3 在啤酒和葡萄酒酿造中的应用  25
    1.5.4 在纺织和洗涤行业中的应用  25
    1.5.5 在造纸和纸浆制造过程中的应用  25
    1.5.6 在农业和基础研究中的应用  25-26
    1.5.7 在生物能源方面的应用  26
  1.6 嗜热微生物来源的纤维素酶和半纤维素酶  26-27
  1.7 目前的研究趋势  27-29
  1.8 本研究的目的和意义  29-30
第二章 云南锡矿酸性废水中木质纤维素降解菌的分离、鉴定及其产酶分析  30-42
  2.1 实验材料  30-31
    2.1.1 样品采集  30
    2.1.2 试剂和主要仪器  30
    2.1.3 引物合成和DNA测序  30
    2.1.4 培养基和溶液  30-31
  2.2 实验方法  31-35
    2.2.1 PDA平板划线筛选真菌  31
    2.2.2 真菌基因组的提取  31
    2.2.3 真菌的鉴定  31-32
    2.2.4 菌株G5产酶初步筛选  32
    2.2.5 不同碳源诱导下的产酶分析  32-34
    2.2.6 酶液的性质测定  34
    2.2.7 水解试验  34-35
  2.3 结果与分析  35-40
    2.3.1 酸性废水中真菌的分离和鉴定  35-36
    2.3.2 酶活标准曲线  36
    2.3.3 不同碳源对G5产纤维素酶的影响  36-37
    2.3.4 酶液性质测定(以Avicel为碳源)  37-39
    2.3.5 水解试验  39-40
  2.4. 讨论  40-42
第三章 Phialophora sp.G5来源的纤维素酶基因的克隆和表达  42-85
  第一节 内切葡聚糖酶EgG5和EgGH45克隆表达和性质研究  42-66
    1.1 实验材料  42-43
      1.1.1 菌株、载体和内切葡聚糖酶基因egG5、egGH45  42
      1.1.2 引物合成和核酸测序  42
      1.1.3 试剂盒、酶和生化试剂  42
      1.1.4 主要仪器  42
      1.1.5 试剂  42-43
      1.1.6 培养基  43
    1.2 实验方法  43-52
      1.2.1 真菌来源的GH5和GH45内切葡聚糖酶基因的简并引物设计  43-44
      1.2.2 基因组DNA的提取  44
      1.2.3 RNA的提取  44-45
      1.2.4 egG5和egGH45基因的克隆  45-48
      1.2.5 序列及结构分析  48
      1.2.6 EgG5缺失CBM和β-sheet突变  48
      1.2.7 表达载体的构建  48-49
      1.2.8 EgG5、EgG5-CBM、EgG5-Mut、EgGH45表达和纯化  49-51
      1.2.9 酶学性质分析  51-52
      1.2.10 EgG5和EgG5-CBM与微晶纤维素的结合实验  52
      1.2.11 EgG5及EgG5-Mut圆二色光谱分析其二级结构  52
    1.3 结果与分析  52-63
      1.3.1 EgG5和EgGH45序列及结构分析  52-56
      1.3.2 表达载体pPIC9-egG5及其突变体和pPIC9-egGH45的构建  56
      1.3.3 目标基因在毕赤酵母中的诱导表达及纯化  56-57
      1.3.4 内切葡聚糖酶的酶学性质分析  57-63
    1.4 讨论  63-66
  第二节 Phialophora SP.G5的外切纤维素酶CBH6A的克隆、表达和性质研究  66-77
    2.1 实验材料  66
      2.1.1 菌株、载体和外切葡聚糖酶基因  66
      2.1.2 引物合成和核酸测序  66
      2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  66
      2.1.4 主要仪器  66
      2.1.5 试剂  66
      2.1.6 培养基配制  66
    2.2 实验方法  66-69
      2.2.1 基因的获得  66-68
      2.2.2 序列及结构分析  68
      2.2.3 表达载体的构建  68
      2.2.4 pPIC9-cbh6A在毕赤酵母中的表达及纯化  68
      2.2.5 酶学性质分析  68-69
    2.3 结果与分析  69-75
      2.3.1 序列及三维结构分析  69-70
      2.3.2 表达载体的构建  70
      2.3.3 CBH6A在毕赤酵母中的表达及纯化  70-71
      2.3.4 重组CBH6A的酶学性质分析  71-75
    2.4 讨论  75-77
  第三节 Phialophora SP. G5来源葡萄糖苷酶基因的表达和性质研究  77-85
    3.1 实验材料  77
      3.1.1 菌株、载体和葡萄糖苷酶基因  77
      3.1.2 引物合成和核酸测序  77
      3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  77
      3.1.4 主要仪器  77
      3.1.5 试剂  77
      3.1.6 培养基配制  77
    3.2 实验方法  77-79
      3.2.1 基因全长克隆  77-78
      3.2.2 葡萄糖苷酶的表达与纯化  78-79
      3.2.3 BglGH1的酶学性质分析  79
    3.3 结果与分析  79-84
      3.3.1 序列和结构分析  79-81
      3.3.2 酵母表达载体pPIC9-bglGH1的构建  81
      3.3.3 重组表达载体在毕赤酵母中的表达及纯化  81-82
      3.3.4 葡萄糖苷酶BglGH1的酶学性质分析  82-84
    3.4 讨论  84-85
第四章 GH7β-1,4-葡聚糖酶BglG5的纯化和基因克隆  85-99
  4.1 实验材料  85
    4.1.1 菌株、载体  85
    4.1.2 引物合成和核酸序列测定  85
    4.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  85
    4.1.4 主要仪器  85
    4.1.5 试剂  85
    4.1.6 培养基配制  85
  4.2 实验方法  85-89
    4.2.1 β-1,4-葡聚糖酶BglG5的纯化  85-86
    4.2.2 纯化蛋白的鉴定  86
    4.2.3 纯化蛋白性质测定  86
    4.2.4 模拟胃液下纯化酶的稳定性和对大麦-豆粕型饲料粘度影响  86-87
    4.2.5 纯化酶对大麦麦芽汁粘度的影响  87
    4.2.6 产物分析  87
    4.2.7 纯化酶基因全长的获得  87-89
  4.3 结果与分析  89-97
    4.3.1 β-1,4-葡聚糖酶BglG5的纯化  89-91
    4.3.2 质谱鉴定结果  91
    4.3.3 纯化酶的性质测定  91-93
    4.3.4 底物特异性和动力学分析及和其他酶的比较  93-94
    4.3.5 纯化酶在SGF中的稳定性  94
    4.3.6 水解产物分析  94
    4.3.7 纯化酶BglG5对大麦-豆粕型饲料粘度的影响  94
    4.3.8 纯化酶对麦芽汁过滤速率和粘度的影响  94
    4.3.9 纯化酶基因克隆  94-97
  4.4 讨论  97-99
第五章 Phialophora sp.P13甘露聚糖酶和木聚糖酶的基因克隆与表达  99-119
  第一节 甘露聚糖酶MAN5AP13的克隆和表达  99-111
    1.1 实验材料  99-100
      1.1.1 菌株、载体  99
      1.1.2 引物合成和核酸序列测定  99
      1.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  99
      1.1.4 主要仪器  99
      1.1.5 试剂  99
      1.1.6 培养基配制  99-100
    1.2 实验方法  100-103
      1.2.1 甘露聚糖酶基因man5AP13 DNA的获得  100
      1.2.2 甘露聚糖酶基因man5AP13 cDNA的克隆  100-101
      1.2.3 甘露聚糖酶MAN5AP13在毕赤酵母中的表达和纯化  101-102
      1.2.4 酶活测定和性质分析  102
      1.2.5 水解产物分析  102-103
      1.2.6 在模拟胃液中的稳定性  103
      1.2.7 在模拟胃液中对甘露聚糖(LBG)的降解能力  103
    1.3 结果与分析  103-109
      1.3.1 序列与结构分析  103-105
      1.3.2 蛋白表达和纯化  105
      1.3.3 性质测定  105-108
      1.3.4 底物特异性和动力学分析  108
      1.3.5 水解产物分析  108
      1.3.6 重组酶在模拟胃液中的稳定性  108-109
      1.3.7 重组酶MAN5AP13在模拟胃液条件下对甘露聚糖的降解能力  109
    1.4 讨论  109-111
  第二节 改进简并PCR克隆来源于Phialophora sp.P13的木聚糖酶基因  111-119
    2.1 实验材料  111
      2.1.1 菌株、载体  111
      2.1.2 引物合成和核酸序列测定  111
      2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  111
      2.1.4 主要仪器  111
      2.1.5 试剂  111
      2.1.6 培养基配制  111
    2.2 实验方法  111-114
      2.2.1 RNA的提取和反转录  111-112
      2.2.2 以cDNA为模板克隆木聚糖酶和内切葡聚糖酶保守区  112
      2.2.3 基因全长的获得  112-113
      2.2.4 表达载体的构建  113
      2.2.5 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化  113
      2.2.6 活性重组子的筛选和摇瓶水平的诱导  113
      2.2.7 重组木聚糖酶的纯化  113-114
      2.2.8 重组酶性质测定  114
      2.2.9 底物特异性和动力学分析  114
    2.3 结果与分析  114-118
      2.3.1 序列与结构分析  114-116
      2.3.2 蛋白表达和纯化  116
      2.3.3 性质测定  116-118
      2.3.4 底物特异性和动力学分析  118
    2.4 讨论  118-119
第六章 全文结论  119-121
参考文献  121-135
致谢  135-136
作者简历  136-137

相似论文

  1. 壳聚糖季铵盐金属配合物的热稳定性研究,O634
  2. 氯代甲氧基脂肪酸甲酯的合成及应用研究,TQ414.8
  3. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  4. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  5. 马铃薯甲虫对有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗药性及其机理,S435.32
  6. 丁香假单胞菌番茄致病变种和烟草致病变种egfp标记突变体的构建,S436.412
  7. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  8. 槐糖的提取纯化及其用于间型脉孢菌产纤维素酶的诱导研究,TQ925
  9. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  10. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  11. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  12. 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的分离与结构鉴定,TS201.3
  13. 应急物流通道的选择与评价研究,X43
  14. 瓜类细菌性果斑病菌hrp基因簇部分基因的克隆及功能研究,S436.5
  15. 瓜类细菌性果斑病菌致病相关基因筛选及luxR基因功能分析,S436.5
  16. 4个甘蓝型油菜EMS诱变突变体的初步研究,S565.4
  17. 利用EMS诱变构建甘蓝型油菜突变体库的初步研究,S565.4
  18. 陆地棉矮化突变体Ari1327的形态、生理和分子标记研究,S562
  19. 苏麦3号矮秆密穗突变体NAUH164的遗传分析及突变座位的分子标记定位,S512.1
  20. 小麦Na~+/H~+逆转运蛋白TaNHX2的功能验证及功能域分析,S512.1
  21. 叶绿素缺乏对大豆叶片光能分配及耐光抑制特性的影响,S565.1

中图分类: > 生物科学 > 微生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com