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补肾中药及提取物干预雷公藤多苷所致雄性幼鼠生殖损伤的实验研究

作　者: 任献青
导　师: 丁樱
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中医儿科学
关键词: 补肾中药睾丸间质细胞培养睾酮生殖损伤生精细胞凋亡 SCF/c-kit 雷公藤多苷
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

研究目的雷公藤多苷(GTW)是目前临床上常用的中成药制剂,其临床疗效满意,广泛应用于治疗肾小球疾病、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、银屑病、肿瘤、器官移植等,应用范围涉及儿科、内科、外科、内分泌科、皮肤科、眼科、妇产科等广泛生命科学领域,由于部分医家过分担心其生殖损伤,致临床应用出现较大分歧。儿科临床特别是肾脏病专业近几年使用GTW越来越广泛,但有关GTW对小儿生殖损伤的临床研究很少,有关实验研究的对象均为成年鼠,未见有关雄性幼鼠的研究报道,因此科学评价临床常规剂量GTW对小儿或幼鼠的生殖损伤、如何尽可能减少或减轻其毒副作用已经成为目前亟需研究的课题。由于生殖损伤的临床研究困难较大、时间跨度较长,因此我们在临床随访GTW副作用的同时,以幼年大鼠为研究对象进行该实验研究。本课题通过大鼠体内及体外研究,探讨临床常规剂量GTW对幼年大鼠生殖损害的情况及使用补肾中药(六味地黄丸、菟丝子黄精颗粒、菟丝子黄酮)对其生殖损伤的干预作用,为临床用药提供科学依据。研究方法1体内实验1.1补肾中药及提取物干预GTW所致雄性幼鼠生殖损伤的研究3周龄SD雄性幼鼠60只,随机分为五组:空白组、雷公藤多苷组(多苷组)、六味地黄丸+雷公藤多苷组(六味组)、菟丝子黄精颗粒+雷公藤多苷组(颗粒组)、菟丝子黄酮+雷公藤多苷组(黄酮组),每组12只。空白组每日灌服0.5%羧甲基纤维素钠0.5ml/100g,多苷组每日灌服GTW9mg/kg,六味组每日灌服六味地黄丸1g/kg和GTW 9mg/kg,颗粒组每日灌服菟丝子颗粒1g/kg、黄精颗粒1g/kg和GTW 9mg/kg,黄酮组每日灌服菟丝子黄酮0.1g/kg和GTW 9mg/kg,以上剂量均依据生药用量计算。给药12周,于末次给药1h后取血留取血清检测血清睾酮浓度。取一侧睾丸、附睾称重,计算脏器指数,Bouin液固定观察睾丸附睾组织形态学改变,原位杂交法检测睾丸组织干细胞因子(SCF)表达、免疫组化法检测睾丸组织c-kit表达、TUNEL法检测生精细胞凋亡。1.2补肾中药及提取物对GTW所致生殖损伤雄性大鼠生殖能力的影响3周龄SD雄性幼鼠30只,随机分为五组,每组6只,其分组方法、给药剂量、疗程同第一部分。于末次给药1h后,将所有大鼠分笼喂养,每笼1只,按照1:1比例放入成年雌性大鼠1只,放入15天后取出雄性大鼠处死,详细记录配对的雌性大鼠是否产仔、产仔时间、产仔的数量,观察至雌雄分开后26天。2体外实验2.1大鼠含药血清制备3周龄雄性SD幼年大鼠15只,随机分成5组,分组方法及给药剂量同体内实验,灌药1周,于末次灌药2h后处死,腋下取血留血清供细胞培养使用。2.2 GTW及与补肾中药共作用对体外培养雄性幼鼠原代睾丸间质细胞的影响分离15天龄幼年SD大鼠睾丸间质细胞进行原代细胞培养,将生长良好的细胞分别接种于3张96孔培养板及1张24孔板中。96孔板每张选取30孔,分为6组(上述5组加胎牛血清组,即FBS组),每组5孔,加入细胞悬液培养24h后,按预先分组每孔加入大鼠含药血清继续培养,分别于12h、24h、48h各取1板,取上清液放免法检测睾酮浓度。分别将12h、24h吸取上清液后的培养板中加入MTT于培养箱内继续孵育4 h,吸出上清液,再加入DMSO,使结晶物充分溶解,酶标仪上选择490nm、630nm双波长测定各孔吸光度(OD)值,记录结果。研究结果1体内实验1.1补肾中药及提取物干预GTW所致雄性幼鼠生殖损伤的研究血清睾酮:多苷组、六味组、颗粒组血清睾酮水平均较正常组升高,其中多苷组最高,颗粒组次之,六味组最接近正常组。统计学分析各组均数之间存在显著性差异(P<0.01),组间两两比较显示空白组与多苷组相比有显著性差异(P<0.05)。六味组、颗粒组与多苷组相比其血清睾酮水平虽有不同程度降低,但统计学分析无差异(P>0.05)。而黄酮组血清睾酮浓度较空白组及其他组均低,与多苷组、六味组、颗粒组相比均有显著性差异(P<0.05)。大鼠体重、睾丸重量及睾丸重量指数:空白组大鼠体重最大,其余使用GTW各组体重均不同程度降低,但统计学分析无差异(P>0.05)。六味组、黄酮组与多苷组相比体重均有所增加,统计学分析无差异(P>0.05)。颗粒组体重与多苷组相比略有下降,统计学分析也无差异(P>0.05)。从睾丸重量来看黄酮组>空白组>六味组>颗粒组>多苷组,黄酮组与多苷组有统计学差异(P<0.05),其余各组之间均无显著性差异(P>0.05)。睾丸重量与血清睾酮综合分析可看出各组睾丸重量与血清睾酮浓度成负相关,经相关分析检验具有相关性(r=-0.94093)。从睾丸指数结果看,所有使用GTW的大鼠睾丸指数均大于空白组,但统计学分析无显著性差异(P>0.05)。大鼠附睾重量及附睾重量指数:空白组附睾重量及附睾指数均大于其他各组,其中附睾重量统计学分析具有显著性差异(P<0.05),附睾指数无显著性差异(P>0.05)。中药干预各组附睾重量均大于多苷组,六味组、颗粒组附睾指数均大于多苷组,但统计学分析均无差异(P>0.05)。睾丸、附睾组织形态学改变:空白组大鼠睾丸曲细精管结构清楚,生精细胞规则、数量较多,多苷组曲细精管结果相对紊乱,生精细胞数量减少,其余各组病理改变均较多苷组为轻,细胞数量增多(具体详述见论文相关部分)。睾丸生精细胞数量:空白组睾丸曲细精管中精原细胞及初级精母细胞数量均大于其他各组,其中多苷组数量最少,统计学分析多苷组与其他各组相比均有显著性差异(P<0.05),六味组、颗粒组、黄酮组三组之间统计学分析无显著性差异(P>0.05)。睾丸生精细胞凋亡:空白组可见到少量生精细胞凋亡,多苷组生精细胞凋亡明显多于空白组,统计学分析有显著性差异(P<0.05)。六味组、颗粒组、黄酮组生精细胞凋亡数量与多苷组相比明显减少,统计学分析有显著性差异(P<0.05)。睾丸组织SCF表达OD值测定:多苷组曲细精管SCF表达OD值明显低于空白组,统计学分析具有显著性差异(P<0.05)。中药干预组平均OD值均明显高于多苷组,其中颗粒组、黄酮组的表达较强,统计学分析有显著性差异(P<0.05),但干预组组间比较无显著性差异(P>0.05)。睾丸组织c-kit表达OD值测定:多苷组曲细精管c-kit表达OD值明显低于空白组,但统计学分析无显著性差异(P>0.05),中药干预各组c-kit的表达均比多苷组要强,其中六味组表达最强,但统计学分析各组与空白组、与多苷组及组间均无显著性差异(P>0.05)。1.2补肾中药及提取物对GTW所致生殖损伤雄性大鼠生殖能力的影响所对应雌鼠受孕率比较:空白组所对应雌鼠受孕率最高(83.33%),使用GTW各组所对应雌性大鼠的受孕率均有所下降,其中GTW组最低,但仍有20%(1/5),使用中药干预组均有不同程度的升高,可达到38.89%(7/18)。统计学分析使用GTW合并组与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)。中药干预组与空白组、GTW相比无统计学意义(P>0.05)。各组平均产仔数、平均产仔天数:由于GTW组所对应的雌鼠仅有1只产仔,故无法评价其可靠性。中药干预合并组较空白组均低,但统计学分析无差异(P>0.05)。从平均产仔天数看,除GTW组稍长外,其余各组无明显差异,统计学分析也无差异(P>0.05)。2体外实验2.1 GTW及与补肾中药共作用对体外培养雄性幼鼠间质细胞睾酮分泌的影响FBS组(胎牛血清)上清液中睾酮浓度很低,而其他加入大鼠血清各组睾酮分泌均较FBS为高。空白组睾酮于加入血清后12h分泌较多,之后逐渐下降,其余各组分泌高峰时间推迟,于24h分泌量最大,之后逐渐下降。除黄酮组外,使用GTW各组在12h、24h、48h睾酮分泌量均较正常组下降,统计学分析有显著性差异(P<0.01)。六味组、颗粒组与多苷组相比,均有显著性差异(P<0.05)。六味组与颗粒组相比,三个时点睾酮浓度均较颗粒组升高,在12h时点无统计学差异(P>0.05),24h、48h时点均有显著性差异(P<0.05)。黄酮组上清液睾酮浓度于12h、24h、48h时点均为最高,且超过正常组均值,统计学分析具有显著性差异(P<0.05)。2.2 GTW及与补肾中药共作用对体外培养雄性幼鼠间质细胞增殖的影响12h、24h两个时点均以FBS组、空白组OD值最高,其余使用GTW各组OD值均有不同程度的下降,统计学分析无差异(P>0.05);中药干预各组OD值均较多苷组略有升高,以黄酮组最明显,但统计学分析均无显著性差异(P>0.05)。2.3 GTW及与补肾中药共作用对体外培养雄性幼鼠间质细胞凋亡的影响空白组睾丸间质细胞数量最多,与其他各组相比均有显著性差异(P<0.01),而间质细胞凋亡率与间质细胞数量成负相关,空白组凋亡细胞最少,使用GTW各组睾丸间质细胞凋亡比率明显多于空白组,统计学分析有显著性差异(P<0.05);使用补肾中药干预各组与多苷组相比细胞数量有所增加、细胞凋亡比率明显下降,但统计学分析均无显著性差异(P>0.05)。研究结论1.雷公藤多苷对SD大鼠生殖系统及睾丸、附睾组织有一定的影响。表现在影响血清睾酮浓度、大鼠附睾重量、导致睾丸组织病理损伤、生精细胞数量减少、生精细胞凋亡增加、睾丸组织SCF表达减弱。2.六味地黄丸、菟丝子黄精颗粒、菟丝子黄酮对GTW所致的生殖损伤具有一定的对抗作用。其抗生殖损伤机制可能是通过影响血清睾酮浓度、减轻睾丸组织病理改变、减少生精细胞凋亡、增加睾丸生精细胞数量、增强睾丸组织SCF表达。其在增加大鼠体重和睾丸重量、增强睾丸组织c-kit表达等方面的作用,尚无足够证据证实。3.雷公藤多苷可降低雄性大鼠的生殖能力。补肾中药可提高大鼠的生殖能力。4.雷公藤多苷对体外培养的原代睾丸间质细胞具有一定的影响。表现在上清液睾酮分泌减少、细胞增殖能力下降、细胞凋亡增加。补肾中药及提取物可明显增加间质细胞睾酮分泌,减少细胞凋亡。5.雷公藤多苷对生殖损伤的作用位点包括早期精原细胞和初级精母细胞。6.菟丝子黄酮在多项实验中均表现出了独特的作用,值得进一步深入研究。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要（ABSTRACT）  9-16
英文缩略词语表  16-17
文献综述  17-31
  综述一雷公藤多苷所致生殖损伤及中药减毒增效的研究进展  17-22
  综述二生殖激素、SCF/c-kit 系统、生精细胞凋亡与生殖损伤  22-31
前言  31-33
第一部分补肾中药及提取物干预GTW 所致雄鼠生殖损伤的体内研究  33-63
  实验一补肾中药及提取物对G T W 所致生殖损伤大鼠血清睾酮、睾丸及附睾病理、脏器系数的影响  33-49
    材料与方法  33-37
    结果  37-43
    讨论  43-47
    参考文献  47-49
  实验二补肾中药及其提取物对G T W 所致生殖损伤大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响  49-54
    材料与方法  49-50
    结果  50-52
    讨论  52-53
    参考文献  53-54
  实验三补肾中药及提取物对G T W 所致生殖损伤大鼠睾丸SCF/C-kit表达的影响  54-63
    材料与方法  54-57
    结果  57-59
    讨论  59-61
    参考文献  61-63
第二部分补肾中药及提取物对GTW 所致生殖损伤雄鼠生殖能力的影响  63-68
  材料与方法  63-64
  结果  64-65
  讨论  65-67
  参考文献  67-68
第三部分 GTW 与补肾中药共作用对体外培养雄性幼鼠原代睾丸间质细胞的影响  68-81
  材料与方法  68-71
  结果  71-77
  讨论  77-79
  参考文献  79-81
结语  81-82
致谢  82-83
个人简历  83-85
附图  85-91
  附图1 各组睾丸组织病理图  85-86
  附图2 各组附睾组织病理图  86-87
  附图3 各组生精细胞凋亡图  87-88
  附图4 各组睾丸组织SCF 表达图  88-89
  附图5 各组睾丸组织C-kit 表达图  89-90
  附图6 正常体外培养的睾丸间质细胞图  90-91
  附图7 各组体外培养睾丸间质细胞凋亡图  91

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