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白介素-6对人肝脏药物代谢酶（HCE1、HCE2、CYP3A4）表达的影响及分子机制

作　者: 杨俭
导　师: 胡刚；阎秉芳
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 人孕烷X受体人送羧酸酯酶表达质粒荧光素酶报告基因质粒白介素-6(IL-6) 原代培养人肝细胞 HePG2细胞羧酸酯酶1 羧酸酯酶2 细胞色素P450 3A4(CYP3A4)
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

1985年WHO提出“合理用药要求患者接受的药物适合其临床的需要,药物剂量应符合患者的个体化要求”。药物的剂量、血药浓度和临床效应之间有着直接的关系,这个关系是确定临床服药剂量的基础。其中血药浓度是药效学的最重要参数,受药物代谢酶影响。肝脏是机体代谢和清除药物的主要器官,可表达多种药物代谢酶(Drug-metabolizing enzyme,DMEs)包括Ⅰ相酶(如CYP3A4、HCEs等)、Ⅱ相酶(UGT、GST等)、Ⅲ相酶(各种转运体)。细胞色素P450(Cytochrome P450,CYPs)酶系组成了含铁蛋白超家族。从代谢外源性物质的种类和数量的角度看,它是Ⅰ阶段生物转化中最为重要的酶系。其中,CYP3A4可代谢60%的临床现存处方药物;人羧酸酯酶Human carboxylesterases,HCEs)广泛分布机体的各种组织,承担各种包含酯类药物生物转化的功能,包括激活前药物的作用。很多实验证明,遗传(遗传多态性)、年龄、药物(包括草药)、饮食习惯、吸烟和酗酒等因素可通过直接或间接作用调节DMEs,影响其活性。临床上还发现,在一些病理状态下,尤其是宿主出现炎症反应时,肝脏的DMEs表达降低,活性下调,造成药物清除率明显下降达20-70%,进而引起血浆药物浓度增高产生药物毒性反应。白介素-6(interleukin-6 IL-6)目前被公认为炎症时能引起肝脏炎症反应中最重要的细胞因子之一。除此之外,肿瘤已成为世界各国继心血管疾病之后的第二大威胁人类健康的疾病。在2000年,中国每年新增肿瘤病人160万,死亡130多万人,现患病380万人,预计2050年恶性肿瘤发病和死亡例数将是2000年2倍以上。肿瘤的病因和发生机制并不十分清楚,但与感染炎症密切相关。因此,研究IL-6对CYP3A4、HCE1、HCE2的影响及其机制的调节,可为指导临床合理用药提供理论依据。合理的药物剂量,用药时间,既可提高疗效,避免用药过量,降低毒性反应,又可节约资金,产生巨大社会和经济效益。第一部分相关质粒构建目的:构建人PXR、遗传多态性PXR、HCE1、HCE2等表达质粒、人CYP3A4、HCE1、HCE2荧光素酶报告基因质粒。方法:采用克隆、亚克隆以及点突变技术构建人PXR的表达质粒、人CYP3A4、HCE1、HCE2荧光素酶报告质粒。并进行酶切初步鉴定,序列测定进一步证实。在此基础上,转染细胞用wester blot、荧光素酶活性鉴定其功能。结果:构建包括野生型(wild type,WT)以及人群遗传多态性(polymorphism)12种人PXR表达质粒;包括人和大鼠野生型和人PXR和大鼠PXR杂交的human-rat PXR(hRPXR)16种表达质粒;HCE1和HCE2表达质粒。一系列不同长短含luciferase基因CYP3A4荧光素酶报告质粒;含luciferase基因HCE1和HCE2荧光素酶报告质粒。转染细胞,Western blot证实有相应蛋白表达。结论:证实所构建的质粒正确并具有功能,为探讨IL6对肝脏CYP3A4、HCE1、HCE2的影响及分子机制打下基础。第二部分IL-6抑制人肝细胞HCE1、HCE2表达和活性及分子机制的研究目的:研究IL6对人肝细胞HCE1、HCE2表达和活性的影响,并探讨其分子机制。方法:应用Real-time PCR和Western blot检测IL6处理原代培养人肝细胞或肝肿瘤细胞株HepG2细胞后HCE1、HCE2在mRNA水平和蛋白水平变化,用酶学测定IL-6对人原代培养肝细胞和肝肿瘤细胞株HepG2的HCE1和HCE2酶活性的影响。构建HCE1及其变异体启动子荧光素酶报告基因质粒,探讨IL-6影响HCE1表达和活性的分子机制。结果:IL6明显降低原代培养人肝细胞和肝肿瘤细胞株HepG2的HCE1和HCE2的表达(40-60%)同时降低酶的活性(40-60%)。RNA抑制剂可完全取消IL-6抑制HepG2的HCE1和HCE2表达的作用,以及IL-6可抑制HCE1和HCE2启动子报告基因,提示IL-6抑制HCE1和HCE2的表达和抑制酶活性与其转录抑制有关。并发现IL-6抑制HCElA2转录的部位是位于转录起始部位上游-8213至-7813之间区域。用IL6预处理细胞后,可降低肝细胞HCE1和HCE2的表达和抑制酶的活性,使经这两种酶代谢的药物(如oseltamivir等)的作用和毒性反应发生改变。第三部分IL-6抑制人肝细胞CYP3A4表达和活性及分子机制的研究目的:研究IL-6对人肝细胞CYP3A4表达和活性的影响,并探讨其分子机制。方法:应用Real-time PCR和Western blot检测IL-6处理原代培养人肝细胞或人肝肿瘤细胞(HepG2)后,肝细胞的CYP3A4在mRNA水平和蛋白水平变化,同时测定IL-6对肝细胞CYP3A4酶活性的影响。采用细胞转染PXR表达质粒和SiPXR使核受体PXR过度表达或knockdown以及不同片断CYP3A4启动子荧光素酶报告基因,探讨IL-6影响CYP3A4表达和活性的分子机制。结果:IL-6使原代培养人肝细胞和HepG2的CYP3A4的表达明显降低,酶的活性降低。IL-6可明显抑制CYP3A4荧光素酶报告基因,用SiPXR使细胞PXR基因knockdown,则取消IL-6抑制CYP3A4作用,提示IL-6抑制肝细胞的表达和活性与核受体PXR相关。IL-6可抑制人PXR和大鼠PXR,对自然界人体存在的12种PXR变异体均有抑制作用。此外,研究结果还提示IL6抑制肝细胞表达CYP3A4可能通过DEC1介导。结论:(1)炎症细胞因子可对多种药物代谢酶发挥广泛的抑制作用;(2)IL-6抑制药物代谢酶存在多种机制,独立或共同发挥作用,主要取决于靶基因;(3)IL-6抑制肝细胞CYP450(CYP3A4)的表达具有重要的药理学和毒理学意义。综上所述,本研究工作的主要创新之处在于:1.应用细胞生物学和分子生物学方法研究炎症介质(IL-6)引起药物代谢酶降低的分子机制。2.应用分子克隆技术,构建药物代谢酶启动子报告基因,未预测炎症或其他生理、病理状态下药物代谢酶变化提供分子技术手段。3.首次提出炎症介质(IL-6)引起药物代谢酶(CYP3A4)降低存在多种机制,既影响mRNA转录又影响其降解,既PXR参与,又有可能与DEC1有关。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-20
第一部分:相关质粒的构建  20-36
  引言  20-21
  材料和方法  21-31
  结果  31-34
  讨论  34-36
第二部分:IL-6抑制人肝细胞HCE1、HCE2的表达和活性及其分子机制的研究  36-59
  引言  36-37
  材料和方法  37-43
  结果  43-54
  讨论  54-59
第三部分:IL-6抑制人肝细胞CYP3A4的表达和活性及其分子机制的研究  59-80
  引言  59-60
  材料和方法  60-63
  结果  63-77
  讨论  77-80
附录  80-82
  在读期间发表的研究论文  80-82
综述  82-91
参考文献  91-99
致谢  99-100

白介素-6对人肝脏药物代谢酶（HCE1、HCE2、CYP3A4）表达的影响及分子机制

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