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低氧对HepG2细胞铁调节蛋白1（IRP1）基因表达的影响及其机制

作　者: 骆倩倩
导　师: 朱俐
学　校: 南通大学
专　业: 航空、航天与航海医学
关键词: 缺氧 低氧诱导因子-1 铁调节蛋白1 低氧反应元件HepG2细胞
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的研究低氧对人肝癌HepG2细胞铁调节蛋白1（Iron Regulatory Proteins 1, IRP1）基因表达的影响,探讨低氧对IRP1的调控机制。方法物理（1% O2）或化学缺氧（400 MCoCl2）方式处理HepG2细胞6 h,通过RT-PCR分析IRP1 mRNA的转录水平;QRT-PCR检测缺氧不同时间对IRP1 mRNA转录水平的影响;Western blot检测物理或化学缺氧6 h后低氧诱导因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α）和IRP1的蛋白表达,应用MatInspector软件在线分析预测IRP1基因5’-调控区可能存在的HIF-1结合位点,即低氧反应元件（Hypoxia Responsive Element, HRE）;利用凝胶迁移试验（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）及超迁移试验（Supershift）分析疑似HRE和HIF-1的结合活性;构建含疑似HRE片段的萤光素酶报告基因表达体系,瞬时转染HepG2细胞,物理或化学缺氧处理后,测量萤光值;利用定点突变技术,将HRE核心序列（RCGTG）突变成RAATG,将突变质粒转染HepG2细胞,缺氧处理后测量萤光值;共转染HIF-1α的表达质粒,和上述含疑似HRE或突变序列的质粒,常氧条件培养后,测量萤光值。结果IRP1 mRNA的转录水平在短时程物理缺氧及化学缺氧处理后明显降低;QRT-PCR结果显示短时程物理缺氧时IRP1 mRNA转录水平呈下降趋势,最低点在6 h左右;随着缺氧时间的延长,IRP1 mRNA转录水平则开始升高;缺氧处理6 h后,HepG2细胞内的HIF-1蛋白含量大幅上升,而IRP1的表达量则显著下降;MatInspector软件分析发现,在IRP1基因的5’-调控区存在4个疑似HRE特征序列,分别位于基因的-21756-21740、-21251-21235、-20754-20738及-20753-20737位点（以翻译起始位点为+1）。经EMSA及Supershift试验分析,最终确定IRP1基因5’-调控区-21756-21740的序列（HRE1）在体外与HIF-1有特异性结合;转染了含有HRE1序列报告基因质粒的HepG2细胞,在缺氧条件下萤光值比常氧下显著降低,而不含HRE1片段的质粒或HRE1突变质粒转染后,细胞缺氧处理后的萤光值较之常氧情况,均没有明显变化;共转染HIF-1α表达质粒后,发现转染了含HRE1片段质粒的细胞在正常培养后,其萤光值远小于转染空载质粒细胞,差异有统计学意义。结论缺氧在一定时间内（6小时以内）能抑制IRP1 mRNA的转录,其调控机制是通过HIF-1与IRP1基因5’-调控区的-21756-21740位置上的HRE的结合来抑制IRP1 mRNA的转录并最终影响其蛋白表达。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章 绪论  10-13
第二章 材料与方法  13-35
  2.1 实验材料  13-18
    2.1.1 细胞株和细菌  13
    2.1.2 试剂  13-15
    2.1.3 溶液的配置  15-17
    2.1.4 实验仪器  17-18
  2.2 实验方法  18-34
    2.2.1 细胞培养  18
    2.2.2 细胞基因组DNA 提取  18-19
    2.2.3 细胞m RNA 提取  19
    2.2.4 逆转录  19-20
    2.2.5 RealTime-PCR  20-21
    2.2.6 质粒构建  21-26
    2.2.7 转化及鉴定  26
    2.2.8 重组质粒测序  26-28
    2.2.9 质粒小抽  28
    2.2.10 质粒中抽  28-29
    2.2.11 细胞转染  29-30
    2.2.12 测量萤光数值  30
    2.2.13 细胞总蛋白的提取  30-31
    2.2.14 蛋白浓度的测定  31
    2.2.15 蛋白质免疫印迹实验  31-33
    2.2.16 凝胶迁移试验和超迁移试验  33-34
  2.3 数据处理与统计分析  34-35
第三章 结果  35-43
  3.1 低氧对IRP1 mRNA 转录水平的影响  35-36
  3.2 低氧对HepG2 细胞HIF-1α及IRP1 蛋白表达的影响  36
  3.3 确定人类IRP1 基因5'-调控区HRE 的存在及功能  36-42
    3.3.1 MatInspector 软件分析人类IRP1 基因调控区  36-37
    3.3.2 EMSA 及Supershift 试验对疑似HRE 与 HIF-1 结合能力的分析  37-39
    3.3.3 构建质粒确定疑似HRE的功能  39-41
    3.3.4 共转染试验验证IRP1 调控区HRE 的功能  41-42
  3.4 IRP1 对下游靶基因的调控  42-43
第四章 讨论  43-48
第五章 结论  48-49
参考文献  49-52
英文缩写词表  52-54
综述  54-68
  综述参考文献  63-68
在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目  68-69
  A：在国内外刊物上发表的论文  68
  B：在国际国内学术会议上发表的论文  68
  C：参加的项目  68-69
致谢  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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