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SS表达质粒对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响及调节机制研究

作　者: 张青林
导　师: 杨利国
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 生长抑素 Hela细胞/HepG2细胞/MCF-7细胞细胞增殖/凋亡/周期
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肿瘤是目前所有疾病中威慑力最大的疾病,愈来愈引起人们的重视。因此,研发高效低毒的抗肿瘤药物已成为当前科研工作者的迫切任务。生长抑素因其抑制生长特性,及其广泛分布的受体而备受关注。近年来研究表明,生长抑素及其类似物对肿瘤细胞不但具有抑制增殖的作用,还能诱导其凋亡。本实验将两种生长抑素真核表达质粒(pcS/2SS和pEGS/2SS)转染三种癌细胞、即人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG-2),旨在：(1)分析这两种质粒能否在真核细胞中表达,为开发促生长的基因疫苗奠定基础；(2)探讨并比较这两种生长抑素重组质粒对肿瘤细胞增殖或凋亡的作用及其机制,为开发治疗肿瘤的基因治疗新技术奠定基础。研究内容和结果如下：1 SS表达质粒成功转染肿瘤细胞并表达目的蛋白SS表达质粒热击法转化大肠杆菌DH5a后,大提所得质粒浓度分别为pcS/2SS,1629.7ng/μL; pEGS/2SS,1526.9ng/μL; pcDNA3.0,2072.4 ng/μL; pEGFP-N1,1770.4 ng/μL。SS表达质粒脂质体转染Hela细胞、MCF-7细胞、HepG-2细胞24h后,通过RT-PCR在转录水平能检测到生长抑素目的基因,且荧光显微镜观察到绿色荧光,表明质粒转染成功,顺利表达生长抑素融合蛋白。2 SS表达质粒转染肿瘤细胞后抑制细胞增殖MTT法检测细胞的增殖情况,Hela细胞转染质粒pcS/2SS、pEGS/2SS组与空白对照组相比抑制率分别为33.59%±3.60%,28.08%±1.32%；与阴性对照组相比抑制率分别为12.09%±1.51%,5.50%±2.12%；HepG-2细胞转染质粒组与空白对照组相比抑制率分别为27.12%±2.06%,27.64%±1.44%；与阴性对照组相比抑制率分别为6.65%±0.72%,3.29%±1.47%；MCF-7细胞转染质粒组与空白对照组相比抑制率分别为38.64%±1.52%,37.40%±1.90%；与阴性对照组相比抑制率分别为13.32%±1.34%,16.97%±1.73%；结果表明细胞在转染质粒后增殖均受到抑制。细胞转染质粒后48h,流式细胞仪检测细胞周期变化情况。与空白对照相比,Hela细胞转染质粒组G0/G1期细胞比例基本不变,S期细胞比例显著降低,G2/M期细胞比例显著升高(p<0.05)；HepG2细胞转染质粒后,细胞周期产生变化,但各组差异不显著；MCF-7细胞转染质粒组G0/G1期细胞比例基本不变,S期细胞比例显著升高,G2/M期细胞比例显著降低(p<0.05)。3 SS表达质粒转染肿瘤细胞后诱导细胞凋亡细胞转染质粒后48h,流式细胞仪检测细胞凋亡,Hela细胞空白对照组,转染pcS/2SS、pcDNA3.0、pEGS/2SS、pEGFP-N1实验组细胞凋亡率分别为2.07%±2.88%、17.52%±1.49%、12.15%±5.14%、16.35%±1.82%、13.21%±1.32%;HepG-2细胞凋亡率分别为0.75%±1.03%、27.62%±1.50%、22.93%±3.49%、26.35%±2.31%、22.15%±1.54%；MCF-7细胞凋亡率分别为4.88%±1.62%、25.06%±1.52%、21.50%±4.29%、28.61%±1.76%、22.58%±3.21%；结果表明：(1)转染质粒组与空白对照组相比,转染质粒组可显著提高细胞凋亡率(p<0.01)；(2)试验组与阴性对照组相比,试验组细胞凋亡率更高,但差异不显著；(3)HepG-2、MCF-7组相对于Hela细胞组凋亡率更高,且差异显著(p<0.05)。细胞转染质粒后48h,用实时荧光定量PCR检测分析凋亡相关基因,Hela细胞转染质粒组细胞凋亡促进基因(Bax、原癌基因p53)的表达量显著增加,凋亡抑制基因bcl-2的表达量降低；HepG2细胞凋亡抑制基因bcl-2和凋亡促进基因Bax、p53、NFKB表达量都上调,但差异不显著；MCF-7细胞凋亡促进基因(Bax、原癌基因p53)的表达量显著增加,凋亡抑制基因bcl-2和NFKB的表达量降低。结果表明,细胞凋亡过程中,凋亡相关基因都发生变化,表明细胞凋亡是多通路相互作用的结果。以上结果表明,(1)前期构建的两种生长抑素(SS)表达质粒均可在真核细胞中表达；(2)生长抑素对Hela细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞的细胞增殖、周期、凋亡及凋亡相关基因有显著的调节作用。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词(Abbreviation)  11-12
1 文献综述  12-19
  1.1 生长抑素功能研究进展  12-13
    1.1.1 生长抑素及其类似物结构简述  12-13
    1.1.2 生长抑素临床应用进展  13
  1.2 生长抑素受体研究进展  13-14
  1.3 生长抑素抗肿瘤研究进展  14-18
    1.3.1 部分肿瘤组织及其细胞分布的生长抑素受体研究进展  14-15
    1.3.2 生长抑素抗肿瘤机制研究进展  15-18
  1.4 抑制和治疗肿瘤的方法学进展  18-19
2 研究目的和意义  19-20
3 实验研究  20-44
  3.1 试验材料  20-22
    3.1.1 质粒及细胞株  20
    3.1.2 主要试剂  20-21
    3.1.3 主要仪器设备  21-22
    3.1.4 主要溶液及相关缓冲液  22
  3.2 试验方法  22-29
    3.2.1 质粒热击法转化大肠杆菌DH5α  22-23
    3.2.2 质粒小提鉴定  23
    3.2.3 质粒DNA的大量提取制备  23
    3.2.4 细胞培养  23-24
    3.2.5 质粒的脂质体转染  24-25
    3.2.6 绿色荧光蛋白表达检测  25
    3.2.7 RNA的提取与检测  25-26
    3.2.8 细胞增殖检测  26-27
    3.2.9 细胞凋亡检测  27
    3.2.10 细胞周期检测  27-28
    3.2.11 细胞凋亡相关基因检测  28
    3.2.12 统计分析  28-29
  3.3 实验结果  29-39
    3.3.1 质粒酶切鉴定  29
    3.3.2 质粒DNA的大量提取  29-30
    3.3.3 生长抑素融合蛋白表达  30
    3.3.4 细胞总RNA提取物质量  30-31
    3.3.5 目的基因转录  31-32
    3.3.6 细胞增殖抑制作用  32-33
    3.3.7 细胞凋亡  33-34
    3.3.8 转染后的细胞周期变化  34-37
    3.3.9 细胞凋亡相关基因  37-39
  3.4 讨论  39-43
    3.4.1 生长抑素对细胞增殖和周期的影响  39-40
    3.4.2 生长抑素对细胞凋亡的影响  40-41
    3.4.3 细胞凋亡的分子调控机制  41-43
  3.5 小结  43-44
参考文献  44-49
致谢  49

SS表达质粒对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响及调节机制研究

内容摘要

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