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正常及先天性肛门直肠畸形大鼠盆底肌肉发育的对比研究

作　者: 张世伟
导　师: 王维林
学　校: 中国医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 肛门直肠畸形 盆底肌 胚胎发育 大鼠 Wnt Myogenin MyoD α-SMA 免疫组织化学 逆转录—聚合酶链反应
分类号: R726.5
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


前言先天性肛门直肠畸形（Anorectal Malformations,ARMs）是小儿常见的消化道畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,发病率为1/5000～1/1500。尽管长期以来人们对肛门直肠畸形的手术方式进行着不断的改进,但中、高位ARMs的术后长期随访显示,仍有许多患者存在不同程度的排便、控便功能障碍。术后肛门直肠功能障碍是盆底神经肌肉发育不良所致,而盆底肌肉作为排便控制器官的焦点,无疑是影响直肠肛管控便屏障最重要的因素之一。研究显示,在中、高位肛门直肠畸形中,直肠肛管周围的肌肉和肛管末端平滑肌均有不同程度的改变,但迄今为止,对肛门直肠畸形盆横纹肌和消化道末端平滑肌的胚胎发育过程和病理改变尚不清楚。分子生物学的研究进展已初步阐明肌肉胚胎学发生的机制。生肌调节因子（myogenic regulatory factors,MRFs）在肌肉发育过程中起到了至关重要的作用,肌前体细胞遵循着由生肌调节因子调节的分化途径进行分化。Wnt信号通路在胚胎发育中通过经典信号通路、激酶依赖信号通路调节MRFs的活性;另有观点认为,Wnt信号可能通过参与染色质构象的改变而影响MRFs的活性。Wnt信号对于生肌调节因子的调节作用,已从最初的单一的线性调节通路发展到目前的网络样调节通路。但ARMs盆底肌发育异常的机制目前尚不清楚。本文应用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）致畸的Wistar大鼠ARMs动物模型,通过H&E染色并以MyoD和Myogenin作为胚胎期骨骼肌前体的特异性标志物,以α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）作为胚胎期肠道平滑肌的特异性标志物,研究发育中的盆底横纹肌和消化道末端平滑肌的形态学变化过程;研究Wnt1、MyoD、Myogenin蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠胚胎盆底肌发生过程中的表达情况;探讨正常及ARMs大鼠盆底排便控制相关肌肉的胚胎期形态发育过程和盆底肌发育相关调控因子的表达情况。实验材料实验动物:体重250～300克的Wistar大白鼠由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。试剂:①Myogenin单克隆抗体、α-SMA单克隆抗体购自美国NeoMarker公司;②MyoD单克隆抗体购自美国BD公司;③Wnt1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;④免疫组化UltraSensitiveTMSp超敏试剂盒（产品编号kit-9701,kit-9709）,购自福州迈新生物技术开发有限公司;⑤逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;⑥乙烯硫脲Ethylenethiourea,ETU（C3H6N2S,Lot.:S24419-426）购自Sigma-Aldrich德国公司。实验方法在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天（E10）,按125mg/kg经胃管给予ETU（浓度为1%,以生理盐水做溶剂）,制作ARMs大鼠动物模型,对照组给予等量的生理盐水。分别在大鼠E13、E13.5、E14、E14.5、E15、E16、E17、E18和E21剖宫取胎,在解剖显微镜下获取盆部标本,另取正常出生后1周、2周、4周的幼鼠和成鼠直肠肛管及周围组织标本。一部分标本经4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定、脱水后制成蜡块,行矢状面、横断面和冠状面的连续切片,分别进行如下实验:①H&E染色及MyoD和Myogenin免疫组化染色,以其作为胚胎期骨骼肌的特异性标志物,观察正常和ARMs大鼠SMC和EAS在胚胎期的形态学变化过程。②进行Wnt1、MyoD、Myogenin的免疫组化染色,通过测定阳性反应的平均光密度值（average optical density,AOD）来比较Wnt1、MyoD、Myogenin这些肌肉发生相关因子在盆底肌的表达情况。③进行α-SMA的免疫组化染色,以其作为胚胎期消化道平滑肌的标志物,观察正常和ARMs大鼠后肠平滑肌的形态发育过程;同时比较α-SMA蛋白在两组标本后肠的表达情况。另一部分标本通过显微切割取材获得盆底肌和后肠标本,盆底肌标本进行Wnt1、MyoD、Myogenin mRNA的RT-PCR实验,后肠标本进行α-SMA mRNA的RT-PCR实验,应用G:BOX SYNGENE凝胶分析系统拍照,Koda Digital Science1.0DNA分析软件进行半定量分析。所有数据均以（?）±s表示,差异比较采用SPSS13.0统计软件进行各胎龄正常组与ARMs组的配对t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1、SMC和EAS的发育①SMC的发育情况,E15时,可以在正常组和ARMs组SMC发生的位置观察到散在的MyoD/Myogenin阳性细胞。从E16起,可以观察到盆底肌纤维样肌前体结构。E16时,正常组SMC较为松散地环绕后肠末端,ARMs组SMC的位置、形态及走行与正常组非常相似。E18时,正常组SMC肌结构增粗,与后肠关系稍紧密,而ARMs组SMC的位置、形态、走行发生明显变化,SMC向头侧、腹侧及中线移位,形成一个聚集于尿道后方靠近中线两侧的紧缩环结构;高倍镜下,SMC结构略紊乱,肌束间充填大量的结缔组织;在以后的胚胎发育过程中,正常组和ARMs组的SMC分别延续各自的变化。②EAS的发育情况,以Myogenin作为标志物,观察到从E17开始,EAS散在的肌前体细胞出现于肛管周围会阴部皮下、IAS的外尾侧方,而ARMs组这一结构位于肛凹上方的皮下部;随胚胎发育,EAS逐渐向内侧移位,到胚胎末期位于IAS的尾侧方。EAS在胚胎期发育缓慢,结构纤细,而在出生后生长迅速,并完成其位置的迁移,胚胎末期EAS内、外缘基本处于同一高度,位于IAS末端的尾侧方,出生后EAS外侧缘向头侧生长移位;出生后第1周时,该肌外侧缘已到达到IAS末端水平;到生后第2周时,该肌外侧缘已超过IAS末端,并且有结缔组织插入IAS、EAS及直肠纵肌的肌束间形成网络支架,共同构成肌复合体;出生后4周,EAS外侧缘继续向头侧方生长移位,此时IAS的末端位于EAS的中部;成鼠的EAS和IAS的位置关系与出生后4周大鼠无明显改变。2、盆底肌发育相关因子在正常和ARMs大鼠胚胎期的表达情况①Wnt1免疫组化染色结果,从E13～E21,盆底肌发生的部位均观察到Wnt1的表达;出生后当天,正常组盆底横纹肌仅有零星的Wnt1阳性细胞。E16以前（包括E16）,正常组Wnt1阳性肌前体细胞的AOD值较ARMs组高,具有统计学差异（p＜0.05）;而在E16以后,Wnt1在盆底肌前体的表达情况在正常组和ARMs组没有明显区别两组无统计学差异（p＞0.05）。Wnt1 mRNA RT-PCR结果显示,在E13、E14、E15时,Wnt1在正常组表达水平较ARMs组高,具有统计学差异（p＜0.05）;在E16、E18、E21,两组无统计学差异（p＞0.05）。②MyoD免疫组化染色结果,在E13～E16,在盆底肌发生的部位,均观察到MyoD表达,E16以后无表达;正常组免疫阳性细胞的AOD值较ARMs组强,具有统计学差异（p＜0.05）。MyoD mRNART-PCR结果显示,在E16以前,MyoD在正常组和ARMs组都有表达,正常组表达较ARMs组强,具有统计学差异（p＜0.05）。③Myogenin免疫组化染色结果,从E13～E21,盆底肌发生的部位均观察到Myogenin表达,正常组与ARMs组的免疫阳性细胞的AOD值无明显区别（p＞0.05）。Myogenin mRNA RT-PCR结果显示:Myogenin mRNA RT-PCR结果与免疫组化结果相符。3、后肠平滑肌的发育①后肠环肌层的发育,在E15以前,后肠壁内无α-SMA表达;正常组,从E15开始,在后肠壁内,可以观察到α-SMA标记的原始平滑肌细胞形成一完整的环肌层,后肠末段环肌层略膨大,形成一轻微膨大的末端结构;环肌层肌束连续重叠呈叠瓦状排列,最末段肌束纤维稍斜向上,中部逐渐呈水平,上部纤维斜向内下,具有这一特点的末端微膨大的环肌结构即构成了胚胎期IAS的始基;在以后的胚胎发育过程中,IAS肌束排列方式和末端膨大的情况无明显变化。ARMs组,从E15开始,在后肠壁内,在后肠壁内,可以清晰地观察到α-SMA阳性细胞构成的平滑肌层,也可以观察到环肌层末端的轻度膨大及肌束呈叠瓦样的排列,同时肌纤维也存在与正常组相似的三种方向的排列方式,具有与正常组内括约肌非常相似的结构特点;E16以前后肠后壁内的环肌层尾侧缘尚未到达直肠末端瘘口的边缘。到E17时,后肠后壁环肌层末端已到达瘘口的边缘,后肠环肌层末端膨大部分到达后肠向瘘口过渡的漏斗样结构后逐渐变薄弱,形成锐角结构的末端,而正常组为以钝圆的末端。一直到胚胎期末,ARMs组的IAS情况与E17时相似。②后肠纵肌的发育,E17以前,后肠壁内无直肠纵肌出现,从E17开始,在后肠壁内出现不连续的纵肌片段,到E21时才形成完全连续的薄层纵肌层,但仍较薄弱,后肠末端纵肌较为发散,被结缔组织间隔。纵肌层在正常组和ARMs组发生的时间和形成完整肌层的时间基本相同,直肠纵肌的末端发育较正常组差。出生后IAS及直肠纵肌发育迅速,到出生后2周时,环肌及纵肌末端明显膨大,并有结缔组织形成的网络支架深入穿插于IAS、直肠纵肌和EAS之间,构成的肌复合体,共同包绕肛管。③α-SMA在后肠平滑肌的表达,E15～E21,α-SMA在后肠壁内都有表达,在E15～E16,正常组与ARMs组免疫反应阳性细胞AOD值无统计学差异（p＞0.05）,胚胎第17、18、21天时,ARMs组的免疫反应阳性细胞AOD值较正常组低,具有统计学差异（p＜0.05）。④α-SMA mRNA RT-PCR结果与免疫组化结果相符。结论（1）在正常及ARMs大鼠胚胎,在E15,有散在的SMC肌前体细胞出现在会阴区;可于E16观察到SMC肌纤维样结构;ARMs大鼠胚胎的SMC在E16时,其位置、形态及走行与正常组无明显差异,从E18起,可观察到发育异常的SMC,SMC的胚胎形态学改变晚于畸形的肛门直肠的发生。（2）EAS于E17时出现,在胚胎期发育较缓慢,出生后生长迅速,在出生后4周完成定向生长,最终与IAS和直肠纵肌共同形成肌复合体包绕肛管,畸形组EAS胚胎发育过程中,位于肛凹上方,排列走形紊乱。（3）E14～E16,Wnt1和MyoD在ARMs组盆底肌的表达较正常组弱,Wnt1和MyoD的低表达可能与ARMs盆底肌发育不良相关。（4）后肠平滑肌在E15出现,纵肌发育晚于环肌,ARMs组大鼠胚胎期存在IAS,IAS围绕异位的肛管开口末端,IAS和直肠纵肌的存在不同程度的发育不良。生后2周内仍是直肠肛管平滑肌生长发育及形成肌复合体的重要时期。

全文目录


一、摘要  6-17
  中文论著摘要  6-11
  英文论著摘要  11-17
二、英文缩略语  17
三、论文  17-78
  论文一  17-36
    前言  17
    材料和方法  17-21
    结果  21-30
    讨论  30-35
    结论  35-36
  论文二  36-56
    前言  36
    材料和方法  36-42
    结果  42-52
    讨论  52-55
    结论  55-56
  论文三  56-78
    前言  56
    材料和方法  56-60
    结果  60-69
    讨论  69-77
    结论  77-78
四、本研究创新性的自我评价  78-79
五、参考文献  79-88
六、附录  88-107
  综述  88-105
  在学期间科研成绩  105-106
  致谢  106-107
  个人简介  107

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中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 小儿外科学 > 小儿各生理系统外科学
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