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昆虫杆状病毒AcMNPV ORF38的功能研究及特异性转导B淋巴细胞的重组杆状病毒的构建

作　者: 葛晶
导　师: 钟江
学　校: 复旦大学
专　业: 微生物学
关键词: AcMNPV orf38 Nudix mRNA gp64 表面展示 B淋巴细胞 EBV gp350/220
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分杆状病毒科（Baculoviridae）的成员是一类在自然界中仅感染节肢动物的DNA病毒。苜蓿银纹夜蛾核形多角体病毒（Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV）是该科病毒的模式种,在科研与实践中都具有广泛的作用。近年,人们对杆状病毒开展了大量的研究,对病毒的复制机制、基因组结构及其表达和调控、蛋白的结构和功能、与宿主相互作用的分子生物学基础等有了较为深入的认识。自从1994年AcMNPV全基因组测序工作完成以来,很多必需基因的功能已经被阐释。除了必需基因之外,在杆状病毒的基因组中还有一些基因虽然对于病毒的复制来说并不是必需的,但它们却对病毒的复制起着种调节作用。因此,这些基因对病毒的正常复制同样是重要的。AcMNPV的AcORF38就是一个这样的基因。通过生物信息学分析发现,AcORF38蛋白带有焦磷酸水解酶（Nudix水解酶）的保守结构域。克隆表达制备了重组AcORF38蛋白,体外酶活分析证实其具Nudix水解酶的活性,可水解ADP-ribose。在pH=8.0,Mg2+浓度为5mM和AcORF38为28μM时,水解ADP-ribose的Km值为204μM,Kcat=6.96 s-1。RT-PCR证实,该基因确实在病毒感染的早期表达。进一步构建了orf38缺失的重组病毒vAcGFP-Δ38,证实该基因并不是病毒完成复制所必须的。但同时也发现vAcGFP-Δ38感染Sf9细胞后,出芽型病毒的效价仅为对照病毒的1/300,表明病毒的正常复制受到影响。因此,AcORF38对AcMNPV的正常复制有重要作用。为了研究AcORF38蛋白的作用机理,用电子显微镜比较了缺陷病毒和野生型病毒感染细胞的细胞病理学,发现缺陷病毒感染的细胞中病毒粒子数量远多于野生型病毒。进一步又用实时定量PCR法,分析了病毒早期基因表达,和病毒基因组复制的情况,发现缺陷病毒基因组合成水平及四个早期基因,lef-2,lef-3,dnapol和p143的转录水平也远高于野生型病毒。这提示AcORF38可以降低感染早期病毒基因的转录水平和DNA合成水平。进一步用AcORF38表达质粒和报告基因质粒共转染昆虫Sf9细胞,发现AcORF38表达不仅能降低报告基因egfp的表达和细胞荧光强度,同时还能降低细胞actin基因的mRNA水平。用CMV启动子在哺乳动物细胞HEK293等5株细胞中表达AcORF38,也观察到同样的结果。这些结果表明AcORF38可以非特异性地降低mRNA的水平。考虑到AcORF38作为Nudix水解酶的特性,初步推测AcORF38可能参与真核mRNA帽子结构的降解。为此,分别用ADP-ribose和mRNA帽子结构模拟物m7GpppG作为AcORF38的底物,进行水解反应,测得的米氏常数显示相对ADP-Ribose而言,m7GpppG更适合作为AcORF38的底物。总之,AcORF38对细胞和病毒的基因的表达有负调控作用,且这种调控作用没有专一性,推测可能是通过水解mRNA帽子结构来实现的。AcORF38的这种调控作用,有可能可以避免早期调控蛋白的过度表达,保证病毒正常复制。其确切的机理还有待深入研究。第二部分杆状病毒作为哺乳动物细胞基因转移的载体有很多独特的优点,包括:安全性好,在哺乳动物中不能复制;对外源基因的容量大,其核衣壳至少可以容纳100kb的外源基因;毒副作用小,即使在高MOI感染时也不会引起细胞毒性等等。但它也存在对一些细胞,包括B淋巴细胞,侵入效率低等问题。为了提高杆状病毒对B淋巴细胞的转导效率,本课题首次通过杆状病毒表面展示技术,对病毒的表面蛋白GP64分子进行修饰。采用"贪婪展示"的策略,即每一分子的GP64都是插入了外源短肽的),将人类EBV的表面蛋白GP350/220中能和成熟B淋巴细胞表面分子CD21相互结合的一段十肽,EDPGFFNVEI,成功地展示在重组病毒表面,得到重组病毒vAc-gp350EGFP。用重组病毒转导Raji细胞能使其EGFP的阳性率从0.05%上升至12.6%,同时用其它四株无论是EBV阳性或是EBV阴性的B淋巴细胞HR1,B95-8,BJAB,和DG75也都得到了类似的结果。进一步的实验发现用CD21的抗体处理B淋巴细胞,能竞争性地抑制该重组病毒对细胞的转导,提示重组病毒确实是通过与B淋巴细胞表面CD21蛋白以配-受体结合的方式相互作用,提高病毒转导效率的。本研究的结果大大提高了杆状病毒转导B淋巴细胞的效率和外源基因的表达水平,使杆状病毒有可能用于转导B淋巴细胞。此外,本研究的实验途径,可以广泛地应用于利用已知的受-配体关系改造杆状病毒,扩大其可以转导的哺乳动物细胞的范围,获得高效特异的病毒载体。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
第一章 杆状病毒orf38基因功能的研究  9-44
  第一节 引言  9-10
  第二节 材料与方法  10-24
  第三节 实验结果  24-39
  第四节 讨论与展望  39-41
  小结  41-42
  参考文献  42-44
第二章 特异性感染淋巴细胞的重组杆状病毒的构建  44-60
  第一节 引言  44-45
  第二节 材料与方法  45-50
  第三节 实验结果  50-55
  第四节 讨论与展望  55-57
  小结  57-58
  参考文献  58-60
第三章 文献综述  60-114
  第一节 Nudix水解酶  60-79
  第二节 杆状病毒基因组学及基因功能研究  79-86
  第三节 杆状病毒作为哺乳动物细胞基因转移的载体  86-90
  第四节 杆状病毒表面展示技术  90-93
  参考文献  93-114
致谢  114-115
在读期间论文发表情况和获奖情况  115-116

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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