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猪ETEC F4受体相关基因及其相关SNP筛选的研究

作　者: 蒋隽
导　师: 施启顺；柳小春
学　校: 湖南农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 肠毒素大肠杆菌 F4受体 δ差异显示 SNP 仔猪
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


本实验首先采用体外黏附表型检测方法检测了大约克和沙子岭初生仔猪F4三种血清型的黏附型，以期发现其遗传差异性。并从小肠上皮细胞提取总RNA用于下一步的试验，即采用δ差异显示方法寻找与ETEC F4黏附表型相关的基因。并通过筛选与受体相关的SNP，进一步研究相关基因与受体的关系。主要研究结果如下：1．体外黏附测定结果表明，F4 ab黏附素对大约克猪和沙子岭猪均黏附强烈，而F4ac则表现为不黏附。二个品种中均存在较高频率的F4abR~+-acR~-。ad黏附素对沙子岭猪的黏附较强烈(0.400)，而对大约克猪并不强烈黏附(0.242)。上述结果也暗示猪F4 ab受体和ac受体存在较强的连锁而与ad受体并无此关系。2．本实验采用在δ差异显示法共检测到67条差异片段。在F4 ab黏附差异带检测中，检测到22条差异条带，其中有13条在黏附型样品中特异表达，9条在不黏附型样品中特异表达。在F4 ac黏附差异带检测中，共检测到21条差异条带，其中有13条在黏附型中特异表达，8条在不黏附型样品中特异表达。在F4 ad黏附差异带检测中，共检测到24条差异条带，其中有13条在黏附型中特异表达，11条在不黏附型样品中特异表达。3．67条δ差异片段的再扩增PCR中，有7条差异片段没能实现特异性扩增，没作进一步分析。在60个再扩增差异片段中，，Northern blot结果表明有7个差异片段表现为假阳性。找到了53个阳性差异片段，阳性率为88.3％(53／66)。4．克隆载体送测序公司测序后，到NCBI网站进行BLAST比对，本试验共测序了30条片断，其中比对结果有高同源性(＞85％)且同源的长度大于60个碱基的片断有7条，有同源性但低于85％或同源的长度较短的片断有12条，其余11条为新基因片断。本试验将其中20条EST登录到GenBank中，登录号分别为DQ217772，EC268686，DW286736-2867939，EB739624-739627，和EE392468-392477。BLAST结果表明，F4 ab黏附差异带13，与agouti signaling protein(ASIP)有90％(111／123)的同源性；，F4 ac黏附差异带3，与人ATPase，Ca++ transporting，plasma membrane 1(PMCA 1)，有91％(239／260)的同源性。F4 ad黏附差异带9，与glycosylinositolphohatidyl anchor 1(GPI 1)有91％(216／237)的同源性。综合同源比对的结果和对基因功能的了解，选择了ASIP、PMCA 1和GPI 1基因分别为F4ab，ac和ad受体的相关基因，但并不排除其它基因也对于受体的表达有着一定影响。5．对于三个基因，分别设计了4对引物，筛选与受体相关的SNP。结果表明：5．1对于ASIP基因，结果经同源比对后发现，其中由引物1扩增产物在485碱基处，所有黏附型个体的碱基均为G，而所有不黏附型个体的碱基均为A，在第619碱基处，所有黏附型个体的碱基均为A，而所有不黏附型个体的碱基均为T。可见这二个位点的SNP很可能是影响黏附性，也就是影响F4ab受体有无的位点。5．2对于PMCA 1基因，测序结果经同源比对后发现，其中由引物2扩增产物在142碱基处，所有黏附型个体的碱基均为A，而所有不黏附型个体的碱基均为T。可见这个位点的SNP很可能是影响黏附性，也就是影响F4ac受体有无的位点。5．3对于GPI 1基因，结果表明，引物2扩增产物在第242、243碱基位置，所有F4 ad黏附型个体均为AT，而所有不黏附型个体均为TG。可见这个位点的SNP很可能是影响黏附性，也就是影响F4 ad受体有无的位点。5．4而在这3个基因其它位置，虽然发现一些SNP，但这些SNP都与黏附性没有明显的相关性。因此不予考虑。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-29
  1 ETEC F4受体国内外研究现状  12-15
    1.1 F4受体的遗传机制  12-13
    1.2 受体的生化特征  13-14
    1.3、影响受体定型的因素  14-15
  2.基因差异表达研究方法  15-20
    2.1 差异显示PCR法  16-18
    2.2 消减杂交法  18-20
    2.3 应用  20
  3 畜禽抗病育种研究进展  20-25
    3.1 抗病基因的遗传基础  21-22
    3.2 抗病育种的途径  22-25
    3.3 开展抗病育种的困难和存在问题  25
    3.4 展望  25
  4 SNP及其应用  25-27
  5 研究目标与技术路线  27-29
第二章 二个猪种F4受体黏附差异研究  29-35
  1 材料与方法  29-30
    1.1 材料  29
    1.2 方法  29-30
  2 结果与分析  30-33
    2.1 ETEC细菌培养效果  30-31
    2.2 黏附结果  31
    2.3 猪种间黏附差异比较  31-33
  3 讨论  33-34
    3.1 猪种间黏附差异比较  33
    3.2 检测方法  33-34
  4 小结  34-35
第三章 差异片段的获得  35-51
  1 材料与方法  35-43
    1.1 材料  35-37
    1.2 方法  37-43
      1.2.1 总RNA的提取与相关检测  37-39
      1.2.2 总RNA的DNase Ⅰ消化  39-40
      1.2.3 cDNA合成  40-41
      1.2.4 δ差异显示PCR  41-42
      1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显示  42-43
  2 结果与分析  43-48
    2.1 总RNA的检测  43-46
      2.1.1 浓度与纯度检测  43-45
      2.2.2 完整性检测  45-46
    2.3 δ差异显示结果  46-48
  3 讨论  48-50
    3.1 总RNA提取  48-49
    3.2 差异片断  49
    3.3 δ差异显示技术  49-50
  4 小结  50-51
第四章 差异片段的回收、再扩增纯化与Northern blot  51-61
  1 材料与方法  51-58
    1.1 材料  51-52
      1.1.1 凝胶显示差异片段  51
      1.1.2 实验试剂  51-52
    1.2 方法  52-58
      1.2.1 差异片段的回收  52
      1.2.2 差异片段的再扩增  52-53
      1.2.3 再扩增PCR产物的纯化与回收  53-55
      1.2.4 Northern blot  55-58
  2 结果与分析  58-59
    2.1 再扩增结果  58
    2.2 Northern杂交  58-59
  3 讨论  59-60
    3.1 差异片断的选择  59
    3.2 差异片段的回收  59-60
    3.3 Northern blot  60
  4 小结  60-61
第五章 阳性差异片段的克隆、测序与序列分析  61-77
  1 材料与方法  61-67
    1.1 材料  61-63
    1.2 方法  63-67
      1.2.1 克隆  63-66
      1.2.2 测序  66
      1.2.3 序列分析  66-67
  2 结果与分析  67-72
    2.1 克隆  67
      2.1.1 蓝白筛选  67
      2.1.2 质粒DNA克隆片段的鉴定  67
    2.2 测序结果  67-72
    2.3 EST提交  72
  3.讨论  72-75
    3.1 克隆相关问题  72-73
    3.2 用BLAST进行同源比对  73-74
    3.3 相关基因分析  74-75
  4 小结  75-77
第六章 猪相关基因SNP筛选  77-87
  1 材料与方法  77-79
    1.1 试验样品  77
    1.2 基因组DNA的提取  77-78
    1.3 各引物的设计  78-79
    1.4 PCR扩增  79
    1.5 扩增产物的回收、纯化  79
    1.6 测序  79
    1.7 SNP筛选  79
  2 结果与分析  79-83
    2.1 引物扩增结果  80-81
    2.2 测序结果及同源性比较  81-83
      2.2.1 ASIP基因扩增产物SNP分析结果  81-82
      2.2.2 PMCA 1基因扩增产物SNP分析结果  82
      2.2.3 GPI 1基因扩增产物SNP分析结果  82-83
  3 讨论  83-86
    3.1 引物设计与PCR反应优化  83-84
    3.2 SNP及其筛选  84-86
  5 小结  86-87
第七章 结论  87-90
参考文献  90-100
附录  100
附录A:部分克隆片断序列峰型图  100-106
附录B:登录的EST结果  106-111
附录C 英文缩略词中英文全称  111-112
附录D:研究中常用试剂的配法  112-113
致谢  113-114
作者简历  114-115

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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