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鳖甲防治肝纤维化及其作用机制的实验研究

作　者: 高建蓉
导　师: 张赤志
学　校: 湖北中医学院
专　业: 中医内科学
关键词: 鳖甲肝纤维化脂质过氧化肝星状细胞细胞因子细胞外基质
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

肝硬化是严重危害人类身心健康的常见病、多发病。肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化的必经途径，是各种慢性肝病的共同病理学基础，是由各种损肝因素（炎症、中毒、慢性淤胆、代谢障碍、血液循环障碍、营养障碍等）诱发的肝细胞变性坏死—炎症反应—纤维结缔组织增生这一反复发作的病理修复反应。其病理学特征为汇管区纤维结缔组织增多，形成细小的条索和菲薄的间隔，并向肝小叶内延伸，但尚未形成假小叶和再生结节。肝纤维化具有可逆性。若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，引起肝小叶及血管等改建，假小叶和结节形成，即发展为肝硬化，病变将难逆转，且对肝脏造成诸多不良影响，如纤维隔中所存在的血管直接将肝动脉及门静脉的血流分流出肝脏，减少与肝实质接触；胶原纤维沉着导致肝窦毛细血管化，阻碍血流与肝细胞接触；肝动脉与门静脉交通支开放，以及小叶中心纤维化阻碍血流进入肝静脉，而加剧门脉高压。临床见有营养障碍、门脉高压、脾亢、腹水等。因此，采取适当措施，将病变终止于肝纤维化阶段甚至逆转至正常，是治疗慢性肝病和预防肝硬化、肝癌的关键。鳖甲作为防治肝纤维化的常用中药，备受人们关注。关于鳖甲防治肝纤维化的剂型，历来存在两种观点，研末吞服、入丸散抑或入汤剂久煎，莫衷一是。本研究通过鳖甲提取物对肝星状细胞影响的实验，以及鳖甲不同剂型体外和在体实验，阐明其抗肝纤维化的作用及可能机制。1．体外实验鳖甲对肝星状细胞的影响1．1鳖甲提取物及鳖甲不同剂型对肝星状细胞增殖的影响目的探讨鳖甲不同剂型对肝星状细胞（HSC）增殖的影响作用，以及鳖甲对HSC增殖影响的物质基础。方法传代培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6与鳖甲不同剂型（散剂、汤剂）含药血清以及鳖甲提取物（蛋白质类物质、分子量大于和小于6000的物质）共同培养48h、72h后，采用MTT比色法测定各浓度组HSC增殖情况。结果鳖甲煎煮液含药血清组MTTOD值低于相应浓度生理盐水对照血清组和鳖甲微粉含药血清组，中位值差异均非常显著，P＜0.001，中位抑制率分别为51.43％、48.76％。鳖甲蛋白类物质组（蛋白质分子量一般在6000-10⁶以上）中位MTTOD值显著高于空白对照组，P＜0.05-0.001，中位抑制率分别为-1016.19％、-61.21％；分子量大于6000物质组中位抑制率分别为-119.76％、-58.91％；鳖甲分子量小于6000物质组MTTOD值低于空白对照组（培养72h结果）和分子量大于6000物质组（培养48h、72h结果），中位值差异均非常显著，P＜0.01-0.001，中位抑制率51.67％（培养72h结果）。结论分析鳖甲成分，鉴于甲壳素、壳聚糖是由β-葡萄糖借β-1，4糖苷键组成的高分子多糖类纤维素，不溶于水，人体消化液不含水解β-1，4糖苷键的纤维素酶，所以不被消化利用。推测鳖甲经煎煮后，起负抑制效应的大分子蛋白变性成为小分子肽类物质而发挥抑制HSC增殖的作用。1．2鳖甲提取物对肝星状细胞活化及胶原合成的影响目的探讨鳖甲提取物是否抑制转化生长因子-β₁（TGF-β₁）刺激的人肝星状细胞系（LX-1细胞）Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ，ColⅠ，C-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen TypeⅢ，ColⅢ，C-Ⅲ）等蛋白表达，以及能否经过调控α-肌动球蛋白（α-SMA）等细胞因子表达而抑制HSC的激活，从而抑制肝纤维化的进展。方法膜透析法提取鳖甲分子量＜6000的物质，Western-blot法检测各组LX-1细胞Coll，ColⅢ、α-SMA蛋白表达。以Actin作为内参照。作空白对照、TGF-β₁刺激对照和干扰素-γ（IFN-γ）对照。结果LX-1细胞鳖甲分子量＜6000物质作用组与对照组相比，α-SMA、ColⅠ、ColⅢ的蛋白表达显著降低（P＜0.05-0.01），并在实验浓度范围呈量效依赖关系。结论鳖甲分子量＜6000物质作用组能显著抑制TGF-β₁刺激的LX-1细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等蛋白表达、显著抑制α-SMA表达而抑制HSC的激活及肝纤维化发生发展。2．在体实验：鳖甲防治肝纤维化大鼠作用及机制研究目的探讨鳖甲不同剂型防治大鼠肝纤维化及其作用机制。方法36只雌性SD大鼠随机分为6组：正常组、肝纤维化模型组、鳖甲煎煮液防治组和治疗组、鳖甲微粉防治组和治疗组。除正常组外，其余五组以40％CCl₄0.12ml／100g体重背部皮下注射，隔日一次，共12周。造模6周，中等度纤维化形成。药物防治组于造模同期分别给以鳖甲微粉煎煮液、鳖甲微粉药液0.27g生药／100g体重灌胃，1／日；药物治疗组于造模第7周开始给以上述药液灌胃。实验12周末，采集大鼠血清及肝组织标本送检。实验数据以（?）±s表示，应用单因素方差分析，计数资料采用Ridit检验法，P＜0.05为差异具有显著性意义。结果2．1常规病理检查结果CCl₄肝纤维化模型组大鼠HE、天狼红染色可见大量肝细胞脂肪变性存在，正常肝小叶结构遭到破坏；汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，组织切片中有大量假小叶形成，SSS计分较正常对照组显著升高（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组大鼠肝细胞脂肪变性程度较模型对照组弱，汇管区较模型对照组扩张，有纤维隔，但多数尚未连接，SSS计分较模型对照组和鳖甲微粉防治组、治疗组明显下降（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2免疫组化结果2．2．1α-SMA正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.05）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．2 Collagen TypeⅠ正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．3 Collagen TypeⅢ正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．4 Collagen TypeⅣ正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．5层粘蛋白（Laminin）正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.05）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．6 TGF-β1正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于肝细胞浆。模型组：主要表达在变性的肝细胞浆。模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．7核因子κB p65（NFκB p65）正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于汇管区和肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在肝细胞浆，肝窦旁细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肌成纤维细胞也有表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．8血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在肝细胞浆，肝窦旁细胞和肌成纤维细胞也有表达；模型组表达较正常对照组显著增加和增强（P＜0.01）。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．2．9基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）正常组：在正常大鼠肝脏呈低水平表达，表达部位局限于肝窦。模型组：表达广泛，呈弥漫性，主要表达在肝细胞浆，肝窦旁细胞和肌成纤维细胞也有表达。模型组表达较正常对照组显著增加和增强。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但表达面积和强度较模型组和鳖甲微粉防治组、治疗组显著减少和减弱（P＜0.01）。鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．3．10 MMP-13正常组：不表达。模型组：主要表达在肌成纤维细胞，肝窦旁细胞少量表达。鳖甲煎煮液防治组和治疗组：表达特点同模型组，但阳性细胞表达数量呈不同程度的减少。2．3血清生化指标与肝胶原含量、氧化指标检测结果2．3．1放免法测定HA结果：模型组较正常组HA水平显著增高（P＜0.01）；鳖甲煎煮液防治组、治疗组较模型组及鳖甲微粉防治组、治疗组显著降低（P＜0.01）；鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．3．2肝胶原含量测定，参考Jimenez等报道的测试方法，计算方法如下：胶原μg／切片（cm²）=(A_540nm-7.78％A_630nm)×1000／37。结果：模型组较正常组胶原含量显著增高（P＜0.01）；鳖甲煎煮液防治组、治疗组较模型组及鳖甲微粉防治组、治疗组显著降低（P＜0.01）；鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．3．3自动生化分析仪检测肝功能结果：模型组较正常组ALT、AST、AKP、r-GT显著增高（P＜0.01）；鳖甲煎煮液防治组、治疗组较模型组及鳖甲微粉防治组、治疗组ALT、AST、AKP、r-GT显著降低(P＜0.01；鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。2．3．4生化法检测肝组织氧化指标结果：模型组较正常组SOD、GSH-PX活性显著降低（P＜0.05—0.01），MDA含量显著增高（P＜0.01）；鳖甲煎煮液防治组、治疗组较模型组及鳖甲微粉防治组、治疗组SOD、GSH-PX活性显著增高（P＜0.01），MDA含量显著降低（P＜0.05—0.01）；鳖甲微粉防治组和治疗组与模型组无显著差异。结论：鳖甲煎煮液能有效地预防和治疗大鼠肝纤维化，效果显著，其作用机制可能是通过抗脂质过氧化、改善肝组织病理、改善肝功能、调控细胞因子水平等而发挥抑制HSC激活增殖及ECM合成分泌、促进ECM降解吸收等综合作用，阻断和治疗肝纤维化。鳖甲微粉药液无明显防治肝纤维化作用。

全文目录

一.中文摘要  4-9
二.英文摘要  9-16
三.英文缩略词表  16-17
四.正文  17-57
  前言  17-18
  第一部分体外实验鳖甲对肝星状细胞的影响  18-31
    实验一鳖甲提取物及鳖甲不同剂型对肝星状细胞增殖的影响  19-26
      1.材料与方法  19-22
      2.结果  22
      3.讨论  22-26
    实验二鳖甲小分子提取物对肝星状细胞活化及胶原合成的影响  26-31
      1.材料与方法  26-28
      2.结果  28-29
      3.讨论  29-31
  第二部分在体实验鳖甲防治大鼠肝纤维化及其作用机制的研究  31-56
    实验一鳖甲对肝纤维化大鼠一般情况、肝组织病理、细胞因子、细胞外基质与降解因子等水平的影响  32-47
      1.材料与方法  32-35
      2.结果  35-38
      3.讨论  38-47
    实验二鳖甲对肝纤维化大鼠肝组织氧化损伤的影响  47-53
      1.材料与方法  47-50
      2.结果  50-51
      3.讨论  51-53
    实验三鳖甲对肝纤维化大鼠肝功能、血脂、透明质酸的影响  53-56
      1.材料与方法  53
      2.结果  53
      3.讨论  53-56
  结论  56-57
五.文献综述  57-62
六.参考文献  62-66
七.在校期间发表论文、获奖及承担课题  66-67
八.致谢  67

鳖甲防治肝纤维化及其作用机制的实验研究

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