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胎盘生长因子在小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障中的作用

作　者: 王淳
导　师: 陈誉华
学　校: 中国医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 胎盘生长因子(PLGF) 小细胞肺癌(SCLC) 脑转移 HBMEC Rho/ROCK 紧密连接 RNAi技术
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的流行病学调查表明，大约有10％～30％的肿瘤患者发生原发肿瘤脑部转移，我国每年的新增脑转移瘤病例大约为1.7万。在各种脑转移肿瘤中以肺癌脑转移居多，约占全部病例的30％，其中小细胞型肺癌(small cell lung cancer，SCLC)具有恶性度高，脑转移发生时间早的特点。大约50％的小细胞肺癌患者中有发生脑转移，其中有10％～20％的患者以脑部转移瘤形成为疾病的首发症状，而80％的患者在确诊后两年发生脑转移，病人的致死、致残率高，预后差。因此，探讨小细胞肺癌脑转移的分子机制对于小细胞肺癌的防治具有重要的意义。肿瘤转移是一个复杂多步骤的病理过程，器官血管壁的通透性将影响肿瘤细胞的转移。脑的血管系统具有特殊的解剖结构——血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，这个屏障在一定程度上可以阻止致病因子对脑的侵害，但是小细胞肺癌向器官转移表现出对脑的“亲嗜性”，这一病理特点提示小细胞肺癌可能具有影响血脑屏障通透性的肿瘤特性。近年的研究发现了一些与小细胞肺癌骨转移相关的基因(如Prepro GRP和NMB-R)，并且发现其转移与肺癌细胞表面的酪氨酸激酶受体活性增高有关。本室研究发现，在小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)过程中激活了Rho／ROCK通路，使actin细胞骨架重排，破坏HBMEC间紧密连接(tight junction，TJ)的完整性，从而促进小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障(FEBS letters，2006，580：4252-4260)。但是Rho／ROCK通路的上游信号分子目前尚未阐明。探讨该机制可望为防止小细胞肺癌脑转移提供新的药物作用靶点。近年来，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与恶性肿瘤的关系受到重视，发现在恶性肿瘤组织中VEGF表达上调，不仅能促进肿瘤血管形成、促进肿瘤生长，还能通过促进血管的渗透性来加速肿瘤组织细胞进出血管，因而加速了肿瘤的转移。胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)是VEGF家族中的一员，通过特异性地结合于VEGFR-1／Flt-1而产生生物学活性。目前，有关PLGF的研究不多，PLGF在病理状态下介导组织血管生成；PLGF在许多恶性肿瘤中高表达。但小细胞肺癌是否表达PLGF，PLGF能否介导小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障，迄今尚无文献报道。本研究首先检测了PLGF在肺癌组织及六种肺癌细胞系中的表达，然后研究了PLGF沉默的小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层的情况及PLGF对人脑微血管内皮细胞间紧密连接的影响，期望为阻止小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障提供干预靶点。方法一、免疫组织化学方法和real-time PCR方法检测PLGF在肺癌中的表达1、免疫组织化学方法检测PLGF在肺癌组织标本中的表达(1)石蜡切片的制作(2)S-P免疫组织化学染色(3)免疫组织化学图像灰度值进行t-检验2、实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测肺癌细胞系中PLGF mRNA的表达情况(1)Real time quant Designer 3.0软件设计PLGF、GAPDH两者的引物和Taqman探针(2)利用Trizol试剂提取细胞总RNA(3)重组质粒pUCmT-PLGF的构建(4)重组质粒pUCmT-GAPDH的构建(5)real-time PCR检测人肺癌细胞系中PLGF的mRNA表达水平二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究1、以腺病毒为载体的RNAi载体的构建(1)含目的基因(siPLGF)的穿梭子(shuttle)构建①构建双链siPLGF：双链短发夹oligo DNA退火连接②线性化shuttle空载体与双链siPLGF的连接③重组质粒的转化、筛选和鉴定(2)腺病毒的重组①线性化载体shuttle(si PLGF)②shuttle和pAdEasy腺病毒载体共转化细菌BJ5183③重组子的筛选和鉴定④重组子(Ad-shuttle-siPLGF)的大量扩增2、病毒颗粒的包装(1) HEK293细胞的培养(2)初级病毒颗粒的形成(3)二级病毒颗粒的形成(4)三级病毒颗粒的形成(5)病毒颗粒滴度的测定3、NCI-H250细胞的感染及沉默功能的鉴定(1) NCI-H 250细胞的感染(2) real-time PCR方法鉴定RNA干扰效果4、具有PLGF沉默效应的NCI-H250细胞功能鉴定(1)荧光定量方法检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层的情况(2)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响(3)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型通透性的影响：HRP通过率分析(4)免疫荧光法观察有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层时对紧密连接结构蛋白ZO-1的影响三、PLGF改变脑微血管内皮细胞间紧密连接的分子机制的研究1、检测PLGF重组蛋白对体外培养的HBMEC单层渗透性的影响(1) Trailswell体外血脑屏障模型的建立(2)检测PLGF对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响(3)检测PLGF对辣根过氧化物酶(Horse-radish peroxidase，HRP)穿过率的影响2、观察PLGF重组蛋白对HBMEC间紧密连接结构的影响(1)免疫荧光法观察PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接(tightjunction，TJ)结构蛋白ZO-1的影响(2) Westem blot方法检测PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接结构蛋白occludin的影响3、观察PLGF重组蛋白对Rho酪氨酸激酶活化的影响(1)观察ROCK，Rho，PI3K，PKC，ERK抑制剂作用下，PLGF对HBMEC的诱导作用(2) Pull-down方法检测Rho酪氨酸激酶的活化情况(3) Westernblot方法检测cofilin的变化情况4、免疫荧光法观察HBMEC细胞骨架微丝的变化结果一、PLGF在肺癌中的表达1、免疫组织化学方法检测PLGF在肺癌组织标本中的表达(1)对72例SCLC、45例人肺腺癌、24例人肺鳞癌和5例癌旁组织标本进行免疫组织化学染色，结果显示，在小细胞肺癌、肿鳞癌和肺腺癌中均有PLGF阳性细胞表达。(2)对免疫组织化学染色结果进行灰度扫描，对Integrated OD Average值做t-检验，PLGF在肺腺癌中高表达；在SCLC和肺鳞癌中表达略低于肺腺癌。(3)在72例SCLC中，有20例(27.8％)PLGF高表达，52例(72.2％)PLGF低表达；对PLGF高达表组和PLGF低表达组患者淋巴结转移数目进行比较，p＜0.05，存在统计学意义。2、RT-qPCR检测肺癌细胞系中PLGF mRNA的表达情况六株组织学不同、来源不同的肺癌细胞系中，PLGF mRNA表达水平不同：NCI-H 250细胞(来源于SCLC脑转移灶的细胞株)PLGF高表达；NCI-H 209细胞(来源于SCLC骨髓转移灶的细胞株)PLGF表达略低；NCI-H 446(来源于SCLC胸水渗漏的细胞株)PLGF低表达；A549(肺腺癌细胞系)和BE1、LH7(大细胞肺癌)PLGF也呈低表达。二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究1、以腺病毒为载体的RNAi系统的构建成功构建了携带短发夹siPLGF的穿梭载体：shuttle(siPLGF)，并与腺病毒骨架载体成功重组，获得了六个腺病毒RNAi重组子(Ad-shuttle-siPLGF)。2、完成HEK293细胞三次病毒包装并获得了纯化病毒颗粒，含量为1.5×10~11virus。3、AD-shuttle-si PLGF感染NCI-H 250细胞(1)利用携带si-PLGF腺病毒颗粒感染NCI-H250细胞，感染率可达80％。(2)利用RT-qPCR检测感染病毒颗粒的NCI-H250，Ad-shuttle-si PLGF细胞与Ad-shuttle-scramble组细胞相比，PLGF mRNA表达明显降低，并存在统计学意义(p＜0.05)。4、具有PLGF沉默效应的NCI-H 250细胞功能鉴定(1)体外血脑屏障模型的建立在Transwell上铺满人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)单层，测量跨内皮细胞电阻值(Transendothelial electrical resistance，TEER)，当TEER≥200 ohm．cm2时，证明体外血脑屏障模型构建成功。(2)利用体外血脑屏障模型，比较PLGF沉默的NCI-H 250小细胞肺癌细胞穿过HBMEC单层的情况，与感染Ad-scramble的细胞相比，PLGF沉默的SCLC细胞穿过率明显降低。(3) PLGF沉默的NCI-H 250小细胞肺癌细胞不能引起体外血脑屏障模型TEER的降低。(4) PLGF沉默的NCI-H 250小细胞肺癌细胞对体外血脑屏障模型辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)的通透率也降低。(5) PLGF沉默的NCI-H 250小细胞肺癌细胞对HBMEC间紧密连接(tight junction，TJ)的破坏减低，TJ结构蛋白ZO-1的分布不发生改变。三、PLGF改变脑微血管内皮细胞间紧密连接的分子机制的研究1、外源性PLGF重组蛋白改变体外血脑屏障模型的完整性(1)外源性PLGF重组蛋白加入到体外血脑屏障模型的上室，可引起TEER下降，峰值出现在PLGF作用后30min，并存在时间、剂量依赖性。(2)外源性PLGF重组蛋白加入到体外血脑屏障模型的上室，可引起HBMEC单层对HRP通透率增加。2、外源性PLGF重组蛋白破坏HBMEC间紧密连接结构(1)外源性PLGF重组蛋白可使紧密连接组成蛋白occludin从不可溶的膜分布状态(insoluble-occludin)向胞浆可溶状态转化(solube-occludin)，30min达最高，以后随着时间延长，solube-occludin逐渐减少。(2)外源性PLGF重组蛋白可引起TJ结构蛋白ZO-1的分布发生改变，由原来连续的线性变成阶段性点状分布，这种变化在30min时最为明显。3、外源性PLGF重组蛋白激活HBMEC的Rho／ROCK通路活化(1)当加入ROCK，Rho，PI3K，PKC，ERK抑制剂后，只有ROCK抑制剂Y27632可阻止由PLGF引起的HRP透过率增加。(2)外源性PLGF作用HBMEC 30min后，可检测到Rho-A的活性形式(RhoA-GTP)。(3)利用三种稳定转染的HBMEC细胞：ROCK-WT(即转入pCAG-ROCKwild type的HBMEC)、ROCK-KDIA(即转入pCAG-Rho binding defective dominant negative of ROCK的HBMEC)和pCAG(转入pCAG空载体的HBMEC)，分别用它们构建Transwell体外BBB模型。①外源性PLGF诱导过表达ROCK-WT的HBMEC TEER降低，对HRP通透率增加；②相反，过表达ROCK-KDIA的HBMEC可废除PLGF对TEER和HRP的影响。(4)外源性PLGF诱导过表达ROCK-WT的HBMEC TJ结构蛋白occludin不可溶的膜分柿状态减少，而ROCK-KDIA却未观察到不可溶occludin的改变。(5)检测Rho／ROCK的下游信号分子cofilin的变化，外源性PLGF重组蛋白可引起cofilin由去磷酸化形式向磷酸化形式转变。4、外源性PLGF重组蛋白调整细胞骨架的重排外源性PLGF重组蛋白可调整细胞骨架actin的重排，使actin肌动蛋白丝从胞浆均匀分布，逐渐向膜周凝聚，峰值出现在PLGF作用后30min。结论1、PLGF在小细胞肺癌组织中及在来源于脑转移的小细胞肺癌细胞中高表达。2、采用RNAi技术干预SCLC中PLGF表达，可以阻止其穿过HBMEC单层。3、PLGF通过活化HMBEC的Rho／ROCK通路，引起细胞骨架的重排，破坏TJ的完整性，从而使SCLC细胞穿过BBB。

全文目录

一、摘要  6-18
  中文论著摘要  6-13
  英文论著摘要  13-18
二、英文缩略语  18-19
三、论文  19-72
  论文一 PLGF在小细胞肺癌中表达的研究  19-33
    前言  19-20
    材料与方法  20-25
    实验结果(附图附表)  25-31
    讨论  31-32
    结论  32-33
  论文二 PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层的研究  33-56
    前言  33-34
    材料与方法  34-42
    实验结果(附图附表)  42-53
    讨论  53-55
    结论  55-56
  论文三 PLGF改变脑微血管内皮细胞间紧密连接的分子机制的探讨  56-72
    前言  56-57
    材料与方法  57-61
    实验结果(附图附表)  61-70
    讨论  70-71
    结论  71-72
四、本研究创新性的自我评价  72-73
五、参考文献  73-77
六、附录  77-86
  综述  77-84
  在学期间科研成绩  84-85
  致谢  85-86
  个人简历  86

胎盘生长因子在小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障中的作用

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