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肺泡上皮间紧密及缝隙连接在急性肺损伤中结构及功能的改变

作　者: 王继承
导　师: 于化鹏
学　校: 第一军医大学
专　业: 呼吸内科学
关键词: 急性肺损伤肺泡上皮细胞紧密连接缝隙连接连接蛋白
分类号: R563.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

研究背景：急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是以间质性水肿和肺实质细胞损伤为主要表现的急性呼吸衰竭，后期则发展为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)。其特点是发病急、病情凶险、死亡率高(达50％)，发病机理至今尚未完全阐明，临床上没有特效的治疗方法。因此探讨ALI发病机制和救治方法是当前临床亟待解决的难题之一。肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell，AEC)之间的连接包括紧密连接(Tight junction，TJ)和缝隙连接(Gap junction，GJ)。这两种细胞的连接方式保证了肺泡组织血气屏障的完整性，发挥着调节细胞两侧及细胞内外液体、离子、代谢产物的分布、转移及细胞之间的信号传递。TJ有两个基本的功能，即屏障功能(barrier function，BF)和栅栏功能(fence function，FF)。TJ的屏障功能可以调节水，离子，不同大小的分子甚至是癌细胞通过细胞之间的间隙，其BF与水肿、黄疸、腹泻及肿瘤的转移等病理过程相关。而TJ的栅栏功能则与细胞的极性有关，换言之，TJ就像栅栏一样阻止细胞膜项膜上的分子与侧膜上的分子相互混合，这种功能与肿瘤生物学即细胞极性的丧失有密切的联系。GJ形成的细胞间通道为缝隙连接通道(gap junction channel)，能通过大小约1000Da的物质，可使亲水性的离子、分子、代谢产物或信号转导分子直接弥散，从而发挥门控作用，调节离子、电流、低分子代谢产物在细胞之间的相互转运及分布。研究表明：TJ主要由一些蛋白质组成，包括occludin、claudin、zonula-1(zo-1)、cingulin、symplekin等。自1993年首次发现occludin以来，先后发现了多种occludin亚型及20多种claudin蛋白。其中claudin蛋白被认为是TJ结构中的关键蛋白。GJ是存在于两个相邻的组织细胞之间的特殊的膜通道结构，由两个镜像对称被称为连接子(connexon，Cn)或半通道(hemichannel)的部分组成，其生化成分主要是分子量为28kD的膜蛋白。每个Cn由6个哑铃形的蛋白质亚单位——缝隙连接蛋白(connexin, Cx)组成。这六个亚单位组成横截面呈六角形的亲水性通道的一半，2个Cn镜像对接成1个完整的中心直径约为15A的亲水性通道即缝隙连接通道。在ALI或呼吸窘迫综合症的病例中可以观察到肺泡上皮和内皮细胞构成的屏障受到了严重的损害，从而导致了富含蛋白的液体进入肺泡内。ALI或ARDS病人的临床发展过程因为影响因素的不同而表现各异，但其中最重要的一个机制就是：AEC屏障受损的强度决定了肺损伤的程度。在细胞连接蛋白的研究中，以往多注重其与肿瘤的发生、心血管疾病、器官发育等的关系，但对于细胞连接蛋白，特别是连接蛋白通道与肺损伤的关系研究较少。本研究观察了Wistar大鼠ALI时肺泡上皮间紧密及缝隙连接结构蛋白的变化情况，以探讨ALI与肺泡上皮间TJ及GJ的关系，希望能为ALI的发病机理及防治开拓一个新的研究领域。目的：1、复制油酸(oil acid, OA)致Wistar大鼠急性肺损伤模型，采用光学显微镜观察正常大鼠肺泡结构及急性肺损伤时大鼠肺泡结构的改变情况；通过透射电镜(transmission electron microscope, TEM)和扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察正常及肺损伤大鼠肺泡上皮间连接结构等超微结构的改变情况。2、检测Cx26蛋白、Cx32mRNA在正常及肺损伤大鼠肺组织中的表达情况以探讨急性肺损伤与缝隙连接之间的关系。3、检测Claudin-3蛋白在正常及肺损伤大鼠肺组织中的表达情况以探讨急性肺损伤与紧密连接之间的关系。方法：1．动物模型的复制：采用OA(按0.25ml／Kg体重的剂量)经大鼠尾静脉缓慢注入复制ALI模型，分别于注射OA后1、5、12、24和48小时剪断腹主动脉放血处死，取出肺脏。将取出的一部分肺组织经电镜液固定等处理后分别用扫描电镜和透射电镜观察肺泡超微结构的变化；取出的另一部分肺组织制成蜡块经切片后用HE染色法观察肺组织结构的变化。2．石蜡切片应用免疫组织化学(immunohistochemistry, IH)SP法检测Cx26、Claudin-3在正常肺组织及急性肺损伤组织中的表达，光镜下观察，数出每个随机视野中的阳性细胞数和总细胞数，并计算出每张切片的阳性细胞率。3．石蜡切片应用原位杂交(in situ hybridization, ISH)方法检测Cx32mRNA在正常肺组织及急性肺损伤组织中的表达，光镜下观察，数出每个随机视野中的阳性细胞数和总细胞数，并计算出每张切片的阳性细胞率。4．统计学处理采用SPSS10.0统计软件对各组均数的比较进行单因素方差分析，如有显著性差异，需进一步作多重比较。若方差齐性则采用LSD法作两两间的比较；若方差不齐则采用Tamhane’sT2法作两两比较，检验水准为α=0.05。结果：1．损伤组在注射OA后都出现不同程度的呼吸加快、窘迫、紫绀及泡沫血痰等表现。正常对照组不出现上述表现。取出的损伤肺体积明显增大，呈广泛的充血、水肿及出血样改变，肺边缘变钝，以双侧中、下肺叶病变较重，气管内有粉红色泡沫样痰；HE染色切片光镜下可见肺泡壁明显增宽，肺间质充血、出血、炎性细胞浸润，肺间质和肺泡水肿，肺泡腔内可见淡红染水肿液和大量中性粒细胞渗出。正常对照组肺组织结构无明显变化。2．电镜下肺组织超微结构的改变：透射电镜下急性肺损伤大鼠可见肺间质细胞大量破坏，无法辨认细胞的形态及结构，见不到完整的细胞间连接结构，Ⅰ型肺泡上皮细胞膜断裂，细胞核溶解；而正常大鼠肺泡上皮细胞形态结构完整，肺泡上皮细胞之间存在完整的细胞连接结构。扫描电镜下可见正常大鼠肺泡壁光滑，肺泡内无渗出物质；而急性肺损伤大鼠的肺泡腔内充满颗粒和絮状物质，这些物质与肺泡上皮细胞或肺间质相连并在肺泡腔内缠绕形成球形颗粒或相互连结形成网状结构。3．Cx26的表达及其表达的变化：免疫组化显示Cx26阳性染色主要定位于胞膜上和细胞质中。Cx26在正常组及损伤后1、5、12、24、48小时组的阳性表达率分别为(12.25±1.12)％、(9.11±0.62)％、(5.71±0.52)％、(6.22±0.77)％、(6.64±0.53)％、(8.25±0.53)％。各组Cx26阳性细胞的平均百分率方差齐性(P=0.393)，方差分析有显著性差异(F=115.638，P＜0.001)，进一步用LSD法做各组间的多重比较。LSD检验结果：正常对照组与损伤各组的阳性细胞率有显著性差异(P＜0.001)；损伤后5小时与损伤后12小时组、损伤后12小时与损伤后24小时组间无显著性差异(P值分别为0.115、0.193)；其它各组间的差异有统计学意义(P＜0.05)。损伤5小时后Cx26的阳性表达率有上升趋势。4．CX32mRNA表达及其变化：原位杂交显示Cx32mRNA的表达主要定位于细胞质中。Cx32mRNA在正常组及损伤后1、5、12、24、48小时组的阳性表达率分别为(13.95±1.57)％、(5.53±0.98)％、(4.83±1.00)％、(5.27±0.93)％、(6.80±0.87)％、(8.92±0.73)％。各组Cx32mRNA阳性细胞的平均百分率方差齐性(P=0.201)，方差分析有显著性差异(F=109.804，P＜0.001)，进一步用LSD法做各组间的多重比较。LSD检验结果：正常组与损伤各组比较有显著性差异(P＜0.001)；损伤后48小时组与其余各组比较有显著性差异(P＜0.001)；损伤后1小时组与5小时组、1小时组与12小时组、5小时组与12小时组间比较无显著性差异(P值分别为0.140、0.585、0.348)；其余各组间的比较有显著性差异(P＜0.05)。损伤5小时后Cx32mRNA的阳性表达率有上升趋势。5、claudin-3表达及其变化：免疫组化结果显示claudin-3阳性染色主要定位于胞膜上和细胞质中。claudin-3在正常组及损伤后1、5、12、24、48小时组的阳性表达率分别为(18.45±2.37)％、(12.08±1.10)％、(9.19±1.08)％、(7.75±1.70)％、(11.81±2.07)％、(13.54±1.21)％。各组claudin-3阳性细胞的平均百分率方差齐性(P=0.127)，方差分析有显著性差异(F=50.523，P＜0.001)，进一步用LSD法做各组间的多重比较。LSD检验结果：正常组与损伤各组比较有显著性差异(P＜0.001)；损伤后1小时组与24小时组、1小时组与48小时组、5小时组与12小时组间比较无显著性差异(P值分别为0.714、0.055、0.058)；其余各组间的比较有显著性差异(P＜0.05)。损伤12小时后claudin-3的阳性表达率有上升趋势。结论：1．在ALI的条件下肺泡上皮间的超微结构TJ及GJ受到了严重破坏，这种破坏可能是导致肺间质及肺泡水肿的原因之一。2．缝隙连接蛋白Cx26及Cx32mRNA在ALI各阶段表达变化的规律表明ALI的发生和修复与GJ的损坏和修复存在密切的联系。3．TJ的组成蛋白claudin-3在ALI过程中的变化规律表明ALI的发生和修复与TJ的损坏和修复也存在密切的联系。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
第一章大鼠急性肺损伤动物模型的复制  16-24
  1 材料与方法  16-17
  2 结果  17-24
第二章缝隙连接蛋白在急性肺损伤后表达变化规律的探讨  24-46
  第一节 Cx26在急性肺损伤后表达变化规律的探讨  26-34
    1.材料与方法  26-28
    2.结果  28-34
  第二节 Cx32mRNA在急性肺损伤后表达变化规律的探讨  34-39
    1.材料与方法  34-37
    2.结果  37-39
  第三节讨论  39-46
第三章 Claudin-3在急性肺损伤后表达变化规律的探讨  46-57
  1.材料与方法  47-49
  2.结果  49-50
  3.讨论  50-57
全文小结  57-58
参考文献  58-63
综述  63-72
缩略词表  72-73
在读期间论文发表情况  73-74
致谢  74-75
统计学审稿证明  75-76

肺泡上皮间紧密及缝隙连接在急性肺损伤中结构及功能的改变

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