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鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究
作 者: 廖丹葵
导 师: 刘雄民
学 校: 广西大学
专 业: 化学工艺
关键词: 蛋黄蛋白质 酶解 血管紧张素转化酶 降血压肽
分类号: TQ464.7
类 型: 博士论文
年 份: 2006年
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内容摘要
血管紧张素转化酶在血压调节中具有双重的作用,它将无催化活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有活性的血管紧张素Ⅱ,同时,它还可催化降压物质舒缓激肽分解从而导致血压升高。食品蛋白质中存在着活性肽,其中对血管紧张素转化酶具有抑制作用的活性肽(降血压肽)的研究在国内外尤其引人注目,它可通过酶水解食品蛋白质而获得。采用鸡蛋蛋黄蛋白质为原料,经超临界CO2-乙醇萃取出蛋黄油和卵磷脂纯化蛋黄蛋白质,得到含量为74.68%的蛋黄蛋白质,蛋白质含量较传统的溶剂提取法提高了24%。经SDS—PAGE法测定,得蛋黄蛋白主要由35kDa、40kDa、67kDa和100kDa以上分子量的蛋白质组成。用12种蛋白酶酶解蛋黄蛋白质,结果显示所用酶水解产物对ACE皆具有抑制作用;采用体外保温抑制实验将其中活性较好的6种酶解产物进行筛选,确定了产物对ACE的抑制类型,并筛选出酶L为制备蛋黄降血压肽的酶类,其水解产物的IC50为1.19mg/mL。考察了各因素对酶解的影响,得到蛋黄蛋白质酶解作用最适水解时间为300min、温度为45℃、pH为9.5、底物浓度为60g/L、加酶量为0.42g/kg,此时蛋黄蛋白质水解度为17.2%,氮溶解指数为89.09%,平均肽链长度为6.5。建立了酶解蛋黄蛋白质的水解动力学模型,得到其动力学方程为r=(270.2E0-0.4125S0)exp[-0.23(DH)],动力学模型与实验结果吻合较好。蛋黄水解液经活性炭脱色、采用截留分子量为10K和3.5K的超滤膜进行分离,所得蛋黄降血压肽超滤液对ACE抑制活性明显提高;用D61大孔阳离子交换树脂对分子量小于3.5kDa的水解液进行分离,确定了离子交换分离降血压肽的适宜条件为:采用pH4.1、浓度为0.05 mol/L的乙酸钠缓冲溶液+1.0mol/L的NaCl溶液,梯度洗脱,上样量为25mg/mL(湿树脂体积),洗脱速度为0.5mL/min,在此条件下,肽的得率与活性回收率分别为67.2%和73.59%。用Sephadex G-15对离子交换树脂分离出的穿透峰和洗脱峰分别进行分离和纯化,用RP-HPLC分离纯化最大活性组分峰,用RP-HPLC和高效毛细管电泳(HPCE)进行纯度鉴定,经薄层色谱分析和电喷雾质谱鉴定表征了降血压肽EY-1的结构序列为Leu-Tyr-Pro。蛋黄水解液的功能研究实验表明,蛋黄水解液有较好的耐热、耐酸稳定性,并发现不同分子量范围的水解产物具有较好的抗油脂氧化性能。与肠道酶作用结果表明,蛋黄水解液与胃蛋白酶作用后其IC50值由1.19mg/mL变为0.94mg/mL,与胰蛋白酶作用后产物的IC50则增至3.19mg/mL,活性有一定的损失,并经毛细管电泳肽谱图得到证实。
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全文目录
摘要 4-6 ABSTRACT 6-13 第一章 绪论 13-45 1.1 简述 13-18 1.1.1 活性肽的概念与分类 13-15 1.1.2 生物活性肽吸收机制的研究 15-16 1.1.3 生物活性肽的作用与功能 16-18 1.1.4 生物活性肽的生产方法 18 1.2 高血压的产生及血管紧张素酶在血压调节过程中的控制机制 18-20 1.2.1 高血压的产生及分类 18-19 1.2.2 血管紧张素酶在血压调解过程中的控制机制 19-20 1.3 血管紧张素酶抑制剂的作用 20-26 1.3.1 天然血管紧张素酶抑制剂 20-23 1.3.2 合成血管紧张素酶抑制剂 23 1.3.3 降血压肽结构与功能的关系 23-26 1.4 食品降血压肽的研究进展 26-31 1.4.1 国外食品降血压肽研究进展 26-27 1.4.2 国内食品降血压肽研究进展 27-28 1.4.3 食品降血压肽的生产方法 28-30 1.4.4 食品降血压肽的应用前景及展望 30-31 1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容 31-33 1.5.1 研究的目的 31-33 1.5.2 研究内容 33 参考文献 33-45 第二章 血管紧张素转化酶抑制剂分析方法的选择 45-56 2.1 前言 45-46 2.2 血管紧张素转化酶体外活性测定原理 46-47 2.3 实验药品及仪器 47 2.3.1 实验药品 47 2.3.2 实验仪器 47 2.4 实验方法 47-49 2.4.1 Hip和HHL特征波长的确定 47 2.4.2 采用HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法 47-48 2.4.3 马尿酸(Hip)的回收率测定 48-49 2.5 实验结果及讨论 49-53 2.5.1 Hip和HHL特征波长 49 2.5.2 马尿酸的浓度和峰值的关系 49-50 2.5.3 HPLC测定ACE抑制肽体外活性的方法 50-51 2.5.4 马尿酸的回收率 51-52 2.5.5 Captopril IC_(50)的标定 52-53 2.5.6 Captopril抑制ACE酶的类型 53 2.6 本章小结 53-54 参考文献 54-56 第三章 蛋黄蛋白质的制备与蛋黄降血压肽的酶系筛选 56-74 3.1 前言 56-58 3.2 实验药品及仪器 58-60 3.2.1 实验药品 58-59 3.2.2 实验仪器 59-60 3.3 实验方法 60-63 3.3.1 原料及产物分析方法 60-61 3.3.2 蛋白质酶解实验及酶系筛选 61-63 3.4 结果与讨论 63-70 3.4.1 蛋黄蛋白质提取物主要成分分析 63-64 3.4.2 蛋黄蛋白质氨基酸分析 64-65 3.4.3 蛋黄蛋白质分子量的测定 65-66 3.4.4 蛋黄蛋白质的酶法水解物对ACE的体外抑制活性效果 66-68 3.4.5 蛋黄酶解物对ACE保温稳定性分析及酶系筛选 68-70 3.5 本章小节 70-71 参考文献 71-74 第四章 蛋黄降血压肽酶解工艺条件优化及动力学研究 74-95 4.1 前言 74-75 4.2 实验材料与设备 75-76 4.2.1 主要仪器 75-76 4.2.2 实验原料及药品 76 4.3 实验方法 76-78 4.3.1 蛋黄蛋白质的酶法水解 76 4.3.2 水解度测定 76-78 4.3.3 酶解产物对ACE体外抑制活性的测定 78 4.3.4 蛋黄降血压肽平均肽链长度的计算方法 78 4.3.5 蛋黄蛋白质酶解液氮溶解指数的测定 78 4.4 酶解动力学研究 78-79 4.5 结果与讨论 79-84 4.5.1 不同时间下水解度(DH)变化及水解度和产物对ACE抑制效果随时间的变化 79-80 4.5.2 肽链长度和ACE抑制效果随水解度的变化 80-81 4.5.3 水解度和氮溶解指数随时间的变化 81 4.5.4 加酶量对水解度的影响 81-82 4.5.5 pH对水解度的影响 82 4.5.6 温度对水解度的影响 82-83 4.5.7 底物浓度对水解度的影响 83-84 4.6 酶解动力学研究 84-92 4.6.1 酶促动力学方程 84-87 4.6.2 酶促动力学模型的参数的确定 87-91 4.6.3 蛋白酶失活的常数确定 91-92 4.6.4 可控酶解的动力学模型验证 92 4.7 本章小节 92-93 参考文献 93-95 第五章 蛋黄降血压肽的分离纯化与结构表征 95-132 5.1 前言 95 5.2 实验药品和设备 95-96 5.2.1 实验材料和药品 95 5.2.2 主要设备 95-96 5.3 实验方法 96-101 5.3.1 蛋黄降血压肽的脱色 96-97 5.3.2 蛋白质浓度的测定方法 97 5.3.3 蛋黄降血压肽的超滤 97-98 5.3.4 离子交换纯化蛋黄降血压肽 98-99 5.3.5 Sephadex G-15纯化蛋黄降血压肽 99 5.3.6 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽 99-100 5.3.7 高效毛细管电泳鉴定EY-1的纯度 100 5.3.8 EY-1的氨基酸分析 100-101 5.3.9 MS测定EY-1的序列 101 5.4 结果和讨论 101-127 5.4.1 脱色对蛋黄降血压肽活性的影响 101-104 5.4.2 超滤分离蛋黄降血压肽 104-108 5.4.3 离子交换纯化蛋黄降血压肽 108-116 5.4.4 Sephadex G-15纯化蛋黄降血缸压肽 116-120 5.4.5 RP-HPLC纯化蛋黄降血压肽 120-122 5.4.6 高效毛细管电泳检验EY-1纯度 122-123 5.4.7 EY-1的氨基酸分析 123-124 5.4.8 MS测定EY-1序列 124-127 5.5 本章小节 127-128 参考文献 128-132 第六章 蛋黄降血压肽的功能性质研究 132-144 6.1 前言 132 6.2 实验仪器和设备 132-133 6.2.1 主要仪器 132-133 6.2.2 实验材料和药品 133 6.3 实验方法 133-134 6.3.1 蛋黄降血压肽的热稳定性研究 133 6.3.2 蛋黄降血压肽的酸稳定性研究 133 6.3.3 蛋黄降血压肽的体外消化道实验研究 133 6.3.4 蛋黄降皿压肽抗肠胃道酶降解的高效毛细管电泳肽谱图 133-134 6.3.5 蛋黄降血压肽抗氧化活性的研究 134 6.4 结果与讨论 134-140 6.4.1 加热时间对蛋黄降血压肽活性的影响 134-135 6.4.2 不同pH对蛋黄降血压肽活性的影响 135 6.4.3 蛋黄降血压肽抗肠胃道酶降解及其高效毛细管电泳肽谱图分析 135-139 6.4.4 不同分子量蛋黄水解物抗氧化活性的研究 139-140 6.5 本章小节 140-141 参考文献 141-144 结论与展望 144-146 致谢 146-147 攻读学位期间发表的文章 147
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产 > 氨基酸、肽、蛋白质
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