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痹愈汤对类风湿性关节炎骨侵蚀治疗机制的实验研究

作　者: 刘洋
导　师: 胡荫奇
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中医内科学
关键词: CIA模型痹愈汤类风湿性关节炎骨侵蚀 MMP-3 TIMP-1 PDGF-A Masson染色
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

背景：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性、对称性多关节炎为主要表现的自身免疫性疾病。本病呈全球性分布，在我国的患病率为0.32％—0.36％，低于欧美国家白种人的1％，是造成我国人群劳动力丧失和致残的主要病因之一。RA的主要病理变化为关节滑膜慢性炎症，炎性细胞浸润，滑膜血管翳形成，血管翳向邻近软骨和骨组织侵蚀，导致骨质破坏，关节畸形和功能丧失。有关RA骨侵蚀的机制及其细胞和分子基础成为近年来研究的热点和难点之一。细胞外基质的降解是造成RA关节软骨、骨侵蚀的主要因素。而基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)两种酶系统在此过程中的作用尤为重要。此外，多种炎性细胞因子亦参与了这一过程。如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素—1(IL—1)、血小板源性生长因子(PDGF)等。它们破坏了RA骨质代谢中的动态平衡系统，作用于软骨基质的降解过程，导致了RA的骨质破坏。类风湿性关节炎属于中医“痹症”范畴。而RA骨侵蚀又可归属于“骨痹”、“历节”、“白虎历节”、“顽痹”、“鹤膝风”等范畴。中医认为，病久肝肾亏虚，筋脉失养，骨损筋挛，外邪内侵，日久痰浊、瘀血交阻于骨骱，凝聚不散，以致关节变形，出现骨侵蚀。现代药理研究证实，补益肝肾、活血化瘀中药能抑制血管增生、血管翳的形成，促进成骨细胞成熟、抑制软骨细胞外基质的降解，因而减轻RA骨侵蚀。中药痹愈汤是我国著名老中医胡荫奇主任医师治疗类风湿关节炎30余年的临床经验总结，由骨碎补、土贝母、徐长卿、伸筋草、莪术组成，具有补肾强骨、活血化瘀、祛风除湿、通络止痛之功能。胶原诱导的关节炎(CIA)模型在免疫病理、临床表现、组织病理变化等方面与人RA最为接近，是目前国际公认的研究RA发病机理、治疗药物的理想动物模型。我们以前的实验已证实痹愈汤可以上调CIA大鼠骨保护素(OPG)的水平，下降RANKL水平，从而抑制破骨细胞的分化和活化，提高破骨细胞的凋亡，抑制骨吸收，减轻关节骨破坏。目的：本实验为进一步阐明中药痹愈汤治疗RA骨侵蚀的机制，采用CIA大鼠模型，经中药痹愈汤高、中剂量组及西药甲氨喋呤组进行对照治疗，HE染色观察其对CIA大鼠踝关节病理结构改变的影响，免疫组化法检测关节软骨MMP-3、TIMP-1、PDGF-A水平的表达，Masson染色观察关节软骨胶原纤维光密度的差异，旨在探讨中药痹愈汤治疗RA骨侵蚀可能的作用机制。方法：(1)选取50只SD雄性大鼠，随机分为五组：正常组、模型组、甲氨喋呤组、痹愈汤中剂量组和痹愈汤高剂量组。每组各10只。除正常组外，每组大鼠双足跖部注射含Ⅱ型胶原的弗氏完全佐剂制作胶原诱导关节炎模型。(2)在造模后1周，除模型组外，各用药组分别连续给药5周，在造模及用药前后观察大鼠的一般情况，并记录体重；用游标卡尺测量右足跖部厚度，观察药物对CIA大鼠一般情况的影响。(3)摘取右侧踝关节进行固定、脱钙、石蜡包埋，HE染色，光镜下观察关节病理变化。(4)免疫组化检测关节软骨的MMP-3、TIMP-1及PDGF-A的表达，并采用计算机图像分析的方法对其表达量进行定量分析。(5)Masson染色观察关节软骨胶原纤维光密度的差异，并采用计算机图像仪对其表达量进行分析。(6)应用SPSS12.0统计软件进行统计分析。结果：1痹愈汤高、中剂量组均能改善CIA大鼠的全身情况，可显著抑制CIA大鼠踝关节肿胀，病理切片显示可减轻滑膜组织增生，炎性细胞浸润，抑制血管翳的形成，减轻骨侵蚀。2免疫组化及统计分析显示：正常组关节软骨仅见少量的MMP—3阳性细胞表达，模型组关节软骨MMP—3阳性染色细胞数量多而密集，模型组大鼠关节软骨MMP-3表达阳性密度、细胞计数显著高于正常组(P＜0.01)；与模型组比较，痹愈汤高、中剂量组及甲氨喋呤组的MMP-3表达阳性密度及细胞计数均降低(P＜0.01)；各治疗组间关节软骨MMP-3的表达无显著性差异(P＞0.05)。但痹愈汤高剂量组MMP—3的表达最少，甲氨喋呤组次之，痹愈汤中剂量组再次之。与正常组比较，模型组大鼠关节软骨TIMP-1的表达阳性密度及细胞计数明显降低(P＜0.05)。痹愈汤高、中剂量组及甲氨喋呤组的TIMP-1表达均明显高于模型组(P＜0.01)。三个治疗组间无显著性差异(P＞0.05)，但痹愈汤高剂量组略TIMP-1的表达优于甲氨喋呤组，甲氨喋呤组稍优于痹愈汤中剂量组。CIA模型大鼠PDGF-A阳性细胞的染色程度、关节软骨染色细胞数、光密度明显增高，与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。与模型组比较，痹愈汤高、中剂量组、甲氨喋呤组均改善了CIA大鼠软骨关节PDGF-A升高的状态(P＜0.01)；痹愈汤治疗组显示了量效关系，高剂量组略优于中剂量组，三个治疗组间无统计学意义(P＞0.05)。3 Masson染色结果及方差分析显示：正常组Masson染色正常，软骨胶原呈蓝色，模型组Masson染色蓝色丢失严重，仅表层软骨尚可保留一些。药物治疗组Masson染色全层软骨保持蓝色着染，但明显着染面积比模型组大。统计学分析显示，与正常组比较，CIA模型组胶原纤维的光密度显著降低(P＜0.05)，与模型组比较，痹愈汤高、中剂量组及甲氨喋呤组可显著提高胶原纤维的光密度(P＜0.01)，三个治疗组间无显著性差异(P＞0.05)，但痹愈汤高剂量组略优于甲氨喋呤组，甲氨喋呤组稍优于痹愈汤中剂量组。结论：通过对痹愈汤治疗CIA大鼠实验研究发现：痹愈汤治疗CIA大鼠疗效明显，其作用机理与下列因素有关：抑制关节软骨中MMP-3的表达，减轻软骨细胞外基质的降解；增加TIMP-1的表达，调整MMP3／TIMP1的失衡，减轻CIA大鼠骨侵蚀，抑制关节软骨PDGF-A的表达，从而减轻关节滑膜炎症，抑制血管翳的形成，改善关节的病理状态。痹愈汤上述疗效与经典抗风湿药MTX相似，且存在明显的量效关系，总体疗效以高剂量组略优于中剂量组。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
第一部分文献综述  14-36
  综述一类风湿性关节炎骨侵蚀机制的研究进展  14-21
  综述二基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与类风湿性关节炎的研究进展  21-28
  综述三中医药对类风湿性关节炎骨侵蚀的病因病机及治法研究  28-36
第二部分实验研究  36-66
  前言  36-37
  1. 材料与方法  37-40
    1.1 实验条件  37
    1.2 主要仪器  37-38
    1.3 药品及试剂  38-39
    1.4 实验方法  39-40
  2. 观测指标  40-45
    2.1 一般观察项目  40
    2.2 病理检测  40-41
    2.3 HE染色  41-42
    2.4 Masson染色  42-43
    2.5 免疫组化检测MMP-3、TIMP-1、PDGF-A  43-44
    2.6 图像分析  44-45
    2.7 统计学分析  45
  3. 实验结果  45-55
    3.1 一般情况  45
    3.2 各组大鼠体重的变化  45-47
    3.3 各组大鼠踝关节肿胀程度的变化  47-48
    3.4 各组大鼠关节软骨MMP-3的表达  48-50
    3.5 各组大鼠关节软骨TIMP-1的表达  50-51
    3.6 各组大鼠关节软骨PDGF-A的表达  51-53
    3.7 各组大鼠关节软骨PDGF-A与MMP-3的相关性分析  53
    3.8 各组大鼠关节软骨胶原纤维光密度变化情况  53-54
    3.9 踝关节病理改变观察  54-55
  4. 结论  55
  5. 讨论  55-64
    5.1 动物模型的选择  55-57
    5.2 阳性对照药物的选择  57-58
    5.3 痹愈汤治疗RA骨侵蚀的中医理论基础  58-59
    5.4 痹愈汤组方功效的分析及现代药理作用  59-61
    5.5 痹愈汤对CIA大鼠治疗作用的机理探讨  61-64
  6. 结语  64-66
    6.1 本课题的特点  64-65
    6.2 后续研究的展望  65-66
参考文献  66-69
附图  69-73
致谢  73-74
个人简历  74

痹愈汤对类风湿性关节炎骨侵蚀治疗机制的实验研究

内容摘要

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