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表没食子儿茶素没食子酸酯对实验性大鼠胰腺纤维化作用及其机制的研究

作　者: 孟敏
导　师: 李延青
学　校: 山东大学
专　业: 内科学
关键词: 慢性胰腺炎胰腺纤维化表没食子儿茶素没食子酸酯氧化应激胰腺星状细胞转化生长因子-β1 Smad
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景胰腺纤维化是慢性胰腺炎的病理特征，其本质是以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多的ECM沉积所致。近年来的研究发现氧化应激、胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSCs）及多种细胞因子与胰腺纤维化密切相关。越来越多的研究显示胰腺纤维化的发生发展与氧化应激、脂质过氧化等有关：氧化应激不仅能够直接导致胰腺细胞损伤，还能激活PSCs，加速纤维化进程。活化的PSCs是胰腺纤维化过程中胶原产生的重要来源。转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁，TGF-β₁）是最强的促纤维化细胞因子，能够激活PSCs，增加PSCs合成分泌ECM；抑制PSCs分泌金属基质蛋白酶，并刺激PSCs分泌蛋白酶抑制剂而减少ECM降解；上调PSCs表达TGF-β₁及其受体，产生自身放大效应；此外，TGF-β₁还能通过调节其他细胞因子的表达，促进纤维化形成。而结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和TGF-β₁具有协同作用，是TGF-β₁发挥生物学效应的下游因子。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）与PSCs的活化和增殖存在密切关系，并且PDGF具有明显的促有丝分裂以及刺激胶原和纤维连接蛋白合成作用。氧化应激、PSCs活化和细胞因子是胰腺纤维化的重要机制，三者之间存在交互作用。脂质过氧化作用刺激PSCs活化，同时氧自由基不断攻击胰腺细胞造成慢性损伤，久而久之形成纤维化；活化后的PSCs分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM和TGF-β₁等细胞因子促进纤维化；TGF-β₁等细胞因子一方面刺激ECM合成，另一方面通过自分泌或旁分泌的形式激活PSCs，加速纤维化形成。现代研究发现，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallte，EGCG）因其儿茶素B环和C环上的酚羟基具有提供质子的活性，能够清除自由基、抑制脂质过氧化、增强其他氧化剂的抗氧化能力，并且具有多种药理作用：抗肿瘤、降低血脂、抗炎和抗纤维化作用。因此推测EGCG对氧化应激所致的胰腺损伤及胰腺纤维化应有保护治疗作用。迄今为止对EGCG对胰腺纤维化的作用及其机制缺乏系统深入的研究，国内外尚无EGCG治疗实验性胰腺纤维化的研究报道。为此，我们利用二乙基二硫代氨基甲酸盐（diethyldithiocarbamate，DDC）诱导大鼠胰腺纤维化模型，采用EGCG对其进行治疗，分别从氧化应激、细胞水平和分子水平探讨EGCG对实验性大鼠胰腺纤维化的作用和机制。研究目的1．应用EGCG对胰腺纤维化大鼠进行治疗，观察各组大鼠胰腺组织病理学变化及EGCG对大鼠胰腺组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和铜锌-超氧化物歧化酶（copper／zinc superoxide dismutase，CuZn-SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-PX）活力的影响，探讨EGCG对大鼠胰腺组织氧化应激损伤的保护作用。2．通过观察大鼠胰腺组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达的变化及Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积的情况，研究EGCG对大鼠PSCs活化的影响，从细胞水平探讨EGCG抗大鼠胰腺纤维化的作用机制。3．通过观察EGCG对大鼠胰腺组织中TGF-β₁及其信号转导蛋白Smad3、Smad7表达的影响，从分子水平探讨EGCG抗大鼠胰腺纤维化的作用机制。研究方法1．动物分组40只雄性Wistar大鼠随机分为5组：模型组、低剂量EGCG组、中剂量EGCG组、高剂量EGCG组和对照组。除对照组外，各组大鼠均给予1ml／100g体重的DDC（用蒸馏水配制成75mg／ml的溶液）腹腔注射，每周两次，共10周。低、中、高剂量EGCG组大鼠在模型组的基础上2周后按1ml／100g体重的剂量给予浓度分别为5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的EGCG灌胃（EGCG均用0.5％羧甲基纤维素钠配成混悬液），每天一次，共8周。对照组给予1ml／100g体重的蒸馏水腹腔注射，每周两次，两周后并给予1ml／100g体重的0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，每天一次。实验10周末处死全部大鼠，留取胰腺组织，将其中一部分迅速保存在液氮罐里，然后转移至低温冰箱-80℃保存，用于组织匀浆蛋白测定及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测；将另外一部分胰腺组织用10％福尔马林溶液固定，用于病理组织学分析和免疫组织化学染色。2．胰腺组织切片H-E染色，在光镜下观察各组大鼠胰腺组织病理学改变。3．应用组织匀浆法及分光光度法测定大鼠胰腺组织中MDA含量和CuZn-SOD、GSH-PX活力。4．胰腺组织切片苦味酸天狼星红染色，在偏振光显微镜下观察大鼠胰腺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积情况，利用计算机图象分析系统计算各组大鼠胰腺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。5．应用免疫组织化学染色方法检测大鼠胰腺组织中α-SMA、TGF-β₁、Smad3、Smad7蛋白的表达，利用计算机图象分析系统进行定量分析。6．应用RT-PCR技术检测胰腺组织中CuZn-SOD、α-SMA、TGF-β₁、Smad3、Smad7 mRNA的表达，利用计算机图象分析系统计算各组目的基因表达的相对系数。7．统计学处理用SPSS12.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示。组间比较采用多样本均数的One-Way ANOVA检验。p＜0.05差异有统计学意义。研究结果1．对照组大鼠胰腺组织无明显病理改变。模型组大鼠中，胰腺组织炎细胞浸润，间质水肿，腺泡萎缩。腺泡和胰岛细胞周围可见到大量微泡，局部还可见广泛的空泡化形成。部分小叶结构消失，小叶内和小叶间纤维结缔组织增生。与模型组大鼠比较，低剂量EGCG组大鼠胰腺组织空泡化程度明显减轻；而高剂量EGCG组大鼠胰腺组织结构接近正常。2．与对照组比较，模型组MDA含量显著升高，CuZn-SOD、GSH-PX活力明显降低；与模型组比较，各剂量EGCG组MDA含量显著下降（p＜0.001），CuZn-SOD、GSH-PX活力显著升高（p＜0.001），且高剂量与低剂量EGCG组比较差异也很显著（p＜0.001）。3．与对照组比较，模型组CuZn-SOD mRNA表达明显下调；与模型组比较，各剂量EGCG组CuZn-SOD mRNA表达显著上调（p＜0.001），而各剂量EGCG组之间比较也有显著性差异（p＜0.001）。4．模型组大鼠胰腺组织中胶原含量明显升高（p＜0.001）；给予EGCG后大鼠胰腺组织胶原含量明显减少（p＜0.001），而且这一作用呈剂量依赖性。5．免疫组织化学染色结果显示：对照组大鼠胰腺组织中仅见少量的α-SMA阳性细胞分布于血管和导管壁中；而模型组大鼠胰腺组织中，可见到大量α-SMA阳性细胞，主要分布于胰腺腺泡周围的纤维化区和胰腺的血管和导管壁；而EGCG组胰腺组织中α-SMA阳性细胞明显减少，其阳性表达平均光密度明显低于模型组（p＜0.001），高剂量与低剂量EGCG组比较α-SMA的表达也有显著差异（p＜0.01）。RT-PCR检测结果显示各组大鼠胰腺组中α-SMA mRNA的表达变化与蛋白的表达变化类似。6．正常对照组大鼠胰腺组织内只有零星分布的TGF-β₁、Smad3阳性细胞；Smad7表达丰富，主要在腺泡细胞、胰腺导管细胞的胞浆内，部分细胞核膜也有表达。模型组大鼠胰腺组织内TGF-β₁、Smad3表达明显增强，主要见于间质的纤维组织、腺泡细胞和胰腺导管细胞的胞质中；Smad7表达极少，主要在胰腺导管细胞的胞浆内。各剂量EGCG组大鼠胰腺组织中TGF-β₁、Smad3表达较模型组下降（p＜0.001），Smad7表达较模型组增强（p＜0.001），尤以高剂量组明显。RT-PCR检测结果显示各组大鼠胰腺组织中TGF-β₁、Smad3、Smad7 mRNA的表达变化与蛋白的表达变化类似。研究结论1．EGCG能明显改善纤维化大鼠胰腺组织病理学变化，有显著治疗胰腺纤维化的作用。2．EGCG通过诱导CuZn-SOD mRNA的表达、提高CuZn-SOD、GSH-PX活力，增强机体的抗氧化能力，阻断氧化过程，抑制脂质过氧化避免其对胰腺细胞长期攻击，从而减轻胰腺损伤，抑制胰腺纤维化。3．EGCG能够抑制大鼠PSCs活化，从而减少细胞外基质的产生，这可能是EGCG抗胰腺纤维化的细胞学基础。4．胰腺损伤后，TGF-β₁生成增多，而Smad3表达上调、Smad7表达下调促进了TGF-β₁的信号传导，进一步加强了TGF-β₁的促纤维化作用。EGCG不仅能够抑制TGF-β₁的产生，而且通过抑制起正反馈作用的Smad3的表达、促进起负反馈作用的Smad7表达，调节二者的平衡，削弱TGF-β₁的信号传导，在多水平阻止TGF-β₁发挥病理作用，这可能是EGCG抑制DDC诱导的大鼠胰腺纤维化的分子机制之一。研究意义本研究首次通过整体实验从氧化应激、细胞水平和分子水平这三个层次深入探讨了EGCG对实验性大鼠胰腺纤维化的作用和机制，结果表明EGCG能明显改善大鼠胰腺组织病理学变化，有显著治疗胰腺纤维化的作用。通过抗氧化应激而抑制PSCs活化，减少TGF-β₁产生，抑制TGF-β₁信号转导可能是EGCG抗胰腺纤维化的重要作用机制。本研究为临床上EGCG应用于抗胰腺纤维化治疗提供了初步的实验依据。

全文目录

中文摘要  8-13
英文摘要  13-19
符号说明  19-21
前言  21-36
  一、氧化应激和胰腺纤维化  21-22
  二、PSCs与胰腺纤维化  22
  三、细胞因子与胰腺纤维化  22-28
  参考文献  28-36
第一部分 EGCG对大鼠胰腺组织氧化应激损伤的保护作用  36-58
  材料和方法  36-47
  结果  47-49
  讨论  49-52
  附图表  52-55
  参考文献  55-58
第二部分 EGCG对大鼠胰腺星状细胞活化的影响  58-73
  材料和方法  58-63
  结果  63-64
  讨论  64-67
  附图表  67-70
  参考文献  70-73
第三部分 EGCG对大鼠胰腺组织TGF-β_1及其信号转导蛋白表达的影响  73-90
  材料和方法  73-76
  结果  76-78
  讨论  78-82
  附图表  82-86
  参考文献  86-90
结论  90-91
致谢  91-92
攻读博士期间发表的学术论文  92-93
学位论文评阅及答辩情况表  93-94
英文论文1  94-112
英文论文2  112-128

表没食子儿茶素没食子酸酯对实验性大鼠胰腺纤维化作用及其机制的研究

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