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番茄AFLP分子遗传连锁图谱的构建及抗病基因Multi-caps标记识别体系建立
作 者: 陈丽静
导 师: 李天来;李君明
学 校: 沈阳农业大学
专 业: 蔬菜学
关键词: 番茄 AFLP RIL 分子遗传图谱 SCAR Multi-CAPS 分子标记辅助育种
分类号: S641.2
类 型: 博士论文
年 份: 2006年
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内容摘要
本研究利用优良栽培番茄品系99165-30与高抗晚疫病不同生理小种的野生多毛番茄LA1777远缘杂交,所获得的F2及其以后世代单粒传得到的F5:6代重组自交系分离群体构建番茄永久饱和的分子遗传图谱,并利用荧光AFLP技术,构建了番茄遗传连锁图谱框架图。同时,针对目前生产中番茄主要病害,利用番茄分子生物学研究的信息和近等基因系,建立了番茄抗番茄根节线虫病基因Mi基因、抗番茄斑萎病毒病基因SW-5基因、抗番茄花叶病毒基因Tm22基因、Tm-1基因、Tm-2基的SCAR标记稳定扩增体系,并在此基础上开发了可以对Mi、Tm22、Sw-5等2个及3个抗病基因同时鉴定筛选的多重PCR体系。主要结果如下: 1.利用银染AFLP方法,从64对E/M的AFLP引物组合中筛选出20对扩增清晰、再现性好的多态性引物;20对引物共扩增出274条多态性条带,平均每对AFLP引物组合扩增出13.7个多态性谱带,其多态性谱带高于目前其他分子标记方法,说明这种方法是一种高效的建图方法。 2.首次利用荧光AFLP方法,对RIL群体中产生分离的274个AFLP标记用JoinMap3.0软件进行分析,得到一张包含125个标记的18个连锁群的遗传图谱,覆盖基因组长度为662cM,标记间平均图距为5.3cM。连锁群长度集中在14~58cM之间,连锁群上的标记数在3~22之间。故此连锁群遗传图谱标记数目高于其他方法。 3.以分别含有五种抗病基因的番茄近等基因系为试材,建立了番茄抗病基因的SCAR-CAPS优化体系,即:50ng模板DNA、2.5μl 10×PCR buffer、200μM dNTPs、1.5UTaq DNA聚合酶、1.5-2.5mM Mg2+,每个引物的浓度为0.2μM,最终体积为25μl。 4.利用上述番茄抗病基因的SCAR-CAPS优化体系,以含五种抗病基因的番茄近等基因系为试材,并利用所设计的5种SCAR正反引物进行扩增,结果表明: ①SCAR1正反引物进行扩增,无论是抗根结线虫材料还是感病材料均只扩增出750bp的特异性片段;经TaqⅠ酶切后,抗根结线虫纯合基因型及杂合基因型材料均存在酶切位点,其中纯合基因型Motelle和Mogeor抗病材料分别产生了570bp和180bp大小的特异性片段,而感病纯合基因型Moneymaker、Movione、Mobaci、Moperou、Mospomor不可以被TaqⅠ切开,仍然呈现原来的750bp的片段。说明利用本引物可用于番茄Mi抗病基因辅助选育。 ②SCAR2正反引物进行扩增试材,只有抗斑萎病材料显性片段为400bp,即抗斑萎病基因型材料产生了400bp的特异产物,感病材料均无PCR产物。且PCR产物无TaqⅠ酶切、HindⅢ酶位点。可用于番茄Sw-5抗病基因辅助选育。 ③SCAR3正反引物扩增试材,无论是抗病材料还是感病材料均都扩增出950bp的特异性片段,经HindⅢ酶切后,纯合感病基因型材料存在酶切位点,其中纯合感病基因型Moneymaker、Motelle、Movione、Mobaci、Moperou、产生了500bp和450bp大小的
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全文目录
英文缩略词 10-12 中文摘要 12-14 英文摘要 14-17 前言 17-18 第一章 番茄分子标记和遗传图谱的研究进展 18-52 1 分子标记研究进展 18-37 1.1 遗传标记的发展 18-27 1.2.AFLP标记 27-32 1.3.番茄分子标记的研究进展 32-37 2 遗传图谱研究进展 37-47 2.1 图谱构建的理论基础 38 2.2 作图群体的建立 38-41 2.3 分子标记遗传图谱的构建 41-43 2.4 遗传图谱的研究意义 43-44 2.5 番茄分子遗传图谱的研究进展 44-47 3 本论文的目的意义和技术路线 47-52 3.1 本论文的目的意义 47-50 3.2 分子标记与遗传图谱构建研究在植物育种上的联系 50-51 3.3 本研究的技术路线及总体设计 51-52 第二章 番茄AFLP分子遗传图谱的构建与分析 52-76 1 引言 52 2 材料与方法 52-61 2.1 材料 52-53 2.2 方法 53-61 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化:(CTAB小量法) 53-54 2.2.2 AFLP分析(银染—用于引物筛选) 54-58 2.2.3 Li-cor AFLP(荧光引物AFLP—图谱构建) 58-61 3 结果与分析 61-69 3.1 模板DNA制备及单酶切检测 61-62 3.2 AFLP反应条件的优化 62 3.3 AFLP引物筛选及多态性分析 62-64 3.4.利用番茄F_(5-6)群体构建的AFLP分子遗传图谱及其基本特征 64-68 3.5 番茄AFLP遗传连锁图谱 68-69 4 讨论 69-75 4.1 AFLP遗传图谱构建效率检测方法评价 69-71 4.2 作图群体的选用 71-72 4.3 分子标记的偏分离及偏分离产生的机制 72 4.4 遗传图谱覆盖的范围及影响 72-73 4.5 图谱的比较和完善 73-74 4.6 开展图谱合并的必要性和可行性 74-75 4.7 连锁群的染色体定位分析 75 5 小结 75-76 第三章 番茄抗病分子标记的Multiplex-CAPS体系的建立 76-95 1 引言 76-78 2 材料与方法 78-83 2.1 材料 78-79 2.2 方法 79-83 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化:(CRAB大量法) 79-80 2.2.2 SCAR反应 80-81 2.2.3 双引物Mutiplex-CAPS反应体系 81-82 2.2.4 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系 82-83 3 结果与分析 83-90 3.1 番茄SCAR优化反应体系的建立 83-84 3.2 番茄五种抗病基因的近等基因系的SCAR-CAPS结果 84-86 3.3 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因双引物Mutiplex-CAPS反应结果 86-89 3.4 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因三引物Mutiplex-CAPS反应结果 89-90 4 讨论 90-93 4.1 SCAR标记技术的关键 90-92 4.2 分子标记用于辅助育种的可能性 92-93 5 小结 93-95 第四章 番茄抗病分子标记Multiplex-CAPS体系的验证及其在育种上的应用 95-107 1 引言 95 2 材料与方法 95-98 2.1 材料 95-96 2.2 方法 96-98 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化 96 2.2.2 SCAR反应 96 2.2.3 单引物SCAR反应体系验证 96 2.2.4 双引物Mutiplex-CAPS反应体系验证 96-97 2.2.5 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系 97 2.2.6 番茄叶霉病高抗基因Cf-9的SCAR-CAPS标记创建 97-98 2.2.7.Cf-9基因和Tm-1基因双基因同时鉴定 98 3 结果与分析 98-104 3.1 与Mi、Sw-5、Tm2~2基因紧密连琐特异标记片段的获得 98-99 3.2 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因双引物Mutiplex-CAPS鉴定结果 99-101 3.3 Mi基因、SW-5基因和Tm2~2基因三引物Mutiplex-CAPS鉴定结果 101-102 3.4 番茄叶霉病高抗基因Cf-9的SCAR-CAPS标记创建 102-103 3.5 Cf-9基因和Tm-1基因双基因同时鉴定 103-104 4.讨论 104 5.结论 104-107 全文结论 107-110 参考文献 110-129 附录 129-133 致谢 133-135 陈丽静同志的简历 135 攻读博士论文期间发表的学术论文 135-136 论文图表统计 136
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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 茄果类 > 番茄(西红柿)
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