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链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化、性质和基因克隆的研究以及溶栓机制的初步探讨

作　者: 王骏
导　师: 王以光；金文藻；王敏
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物药物学
关键词: 纤维蛋白平板纤溶酶原变铅青链霉菌纤溶活性纤维蛋白原活性蛋白结合位点尿激酶赖氨酸缓冲液
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 1997年
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内容摘要

本文报道了从一株土壤链霉菌(Streptomyces sp.)Y405的发酵液中分离纯化到一种新型的具有纤溶活性的蛋白酶SW-1，并对其基本结构和理化性质、纤溶机理、初步药效以及基因克隆进行了研究。链霉菌Y405的96小时发酵液经硫酸铵分级盐析(40-80％饱和度)、290树脂脱色、Sephadex G75凝胶过滤、DEAE Sephadex A25阴离子交换层析(0-1.0mol／L NaCl线性梯度洗脱)和Lysine Sepharose 4B亲和层析(0-0.5mol／L NaCl线性梯度洗脱)，获得链霉菌纤溶酶SW-1。每升发酵液中可获得4.2mg SW-1纯品，回收率为12.0％，每毫克蛋白活力达2952.3尿激酶单位，纯度提高230.6倍，经HPLC检测纯度约为83.5％。该纯化流程已成功地扩大，用于制备纯品。链霉菌纤溶酶SW-1在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中是单肽链蛋白，分子量为30kDa，等电点为8.5，经HPLC纯化的蛋白测定其N-末端氨基酸序列为Arg／Asn／Phe-Pro／Asp-Gly-Met-Thr-Met-Thr-Ala-Ile-Ala-Asn-Gln-Asn-Thr-Gln-Ile-Asn，具有N端序列的不均一性，同时测定了蛋白的氨基酸组成。链霉菌纤溶酶SW-1的纤溶活性可被10mmol／L PMSF、1mmol／L EDTA和1mol／L赖氨酸完全抑制，表明SW-1可能是一种丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，其赖氨酸结合位点与活性有关。SW-1的纤溶活性在4-37℃和pH4.0-9.0具有很好的稳定性，最适pH为8.0。在纤维蛋白加热平板上，SW-1和它与纤溶酶原的混合物表现出相同的纤溶活性，在试管凝块溶解实验中，不加入纤溶酶原也不会影响SW-1对试管中纤维蛋白凝块的溶解，表明SW-1对纤维蛋白具有直接的降解作用，而不具有激活纤溶酶原的活性。SW-1还可降解纤维蛋白原，阻止试管中凝块的形成，表现出抗凝活性，可能是由于降解产物中产生了某种抗凝活性物质。在大鼠腹腔静脉血栓模型中，与生理盐水相比，SW-1(4000u／kg)对血栓具有极显著的溶解效果(P＜0.001)，而与同剂量的尿激酶相比，溶栓效果无差异(P＞0.05)，说明SW-1溶栓活性与尿激酶相当。对大鼠血浆中多种纤溶系统因子的检测显示，SW-1可能促进了内源性t-PA的产生，进而激活纤溶酶原，产生内源性纤溶酶。SW-1和内源性纤溶酶的共同作用引起血浆中纤溶酶

全文目录

ABBREVIATION  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-14
第一部分：链霉菌纤溶酶的分离纯化  14-33
第二部分：链霉菌纤溶酶SW-1理化性质的研究  33-49
第三部分：链霉菌纤溶酶SW-1纤溶机理的初步探讨  49-61
第四部分：链霉菌纤溶酶的基因克隆  61-87
结论  87-89
参考文献  89-94
综述：溶栓药物的分子构效研究进展  94-144
致谢  144-146
后记  146

链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化、性质和基因克隆的研究以及溶栓机制的初步探讨

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