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苹果叶片离体再生不定芽及遗传转化的研究

作　者: 张志宏
导　师: 景士西；王关林
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果叶片再生根癌农杆菌转基因植株
分类号: S661.1
类　型: 博士论文
年　份: 1996年
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内容摘要

本研究以苹果(Malus×domestica Borkh．)栽培品种新乔纳金、皇家嘎拉、宫崎富士和营养系砧木M26为试验材料。通过对影响叶片离体再生不定芽和农杆菌(Agrobacterium)介导的遗传转化的若干因素的研究，建立起高效的苹果再生不定芽系统和遗传转化系统，获得了新乔纳金苹果转基因植株。主要研究结果如下： 1．基本培养基以MS为适宜。用同浓度(W／V％)葡萄糖完全替代MS培养基中蔗糖，不显著影响新乔纳金叶片再生效率；用山梨醇替代蔗糖，明显降低叶片再生效率。培养基中附加细胞分裂素对于苹果叶片再生不定芽是必需的；附加生长素类物质不是必需的，但附加IAA、IBA或NAA(0.1～1.0mg／L)能显著提高叶片再生效率。TDZ是一种适宜于苹果叶片再生的外源细胞分裂素，和BA相比，TDZ表现出三个突出优点：(1)高细胞分裂素活性；(2)宽有效活性范围；(3)降低叶片接种前生理、生化状态对再生效率的影响。交替使用含BA和含TDZ的再生培养基，显著提高新乔纳金叶片再生效率；培养基中同时附加BA和TDZ，叶片再生效率未能表现出累加效应或协同效应。 2．暗培养对于叶片再生不定芽不是必需的，然而接在再生培养基上的叶片先进行2～3周的暗培养，可显著提高苹果叶片再生不定芽效率。 3．再生培养基中附加200～300mg／L头孢霉素对叶片再生没有负作用，当头孢霉素浓度提高至500mg／L时，再生效率明显下降。200mg／L的头孢霉素能够有效抑制共培养后外植体上农杆菌的生长。若叶片直接接在附加选择抗生素的再生培养基上，则12.5mg／L卡那霉素或75.0mg／L新霉素能完全抑制叶片再生；若叶片先在不含选择抗生素的培养基上培养3天以上，然后移至含选择抗生素的培养基上培养，则抗生素浓度至少提高一倍后才能完全抑制叶片再生。与农杆菌共培养后的新乔纳金叶片在附加卡那霉素25mg／L的培养基上能再生转化芽。 4．试材基因型和农杆菌菌株类型是影响苹果遗传转化的很重要因素。外源基因向新乔纳金细胞转移的效率明显高于向皇家嘎拉和宫崎富士细胞转移的效率。用章鱼碱型农杆菌菌株LBA4404(pRCL27)侵染新乔纳金叶片，抗性愈伤组织诱导率为4.7±1.8％，抗性芽诱导率为0.16％；用琥珀碱型农杆菌菌株EHA105(pMOG410)侵染新乔纳金叶片，抗性愈伤组织诱导率为36.0±5.4％，抗性芽诱导率为0.62％。 5．在农杆菌生长培养基中，加入100μM乙酰丁香酮，显著促进LBA4404介导的新乔纳金转化，抗性愈伤组织诱导率从0.6％提高至4.4％，但对EHA105介导的基因转移没有明显影响。用单糖、磷酸饥饿、低pH值等其它vir基因诱导因子处理农杆菌未能显著提高转化效率。苹果叶片在菌液中浸泡时间以5分钟为宜，共培养时间以3天为宜。共培养时，叶片远轴面和培养基接触比近轴面和培养基接触的转化效率高。推迟选择效果和共培养时间有关系，共培养时间和推迟选择时间合在一起以4～5天为宜。共培养培养基为附

全文目录

摘要  5-7
1 引言  7-11
  1.1 植物基因工程发展概况  7-8
  1.2 农杆菌介导的基因转移机理及vir基因表达调控研究进展  8-10
  1.3 苹果生物技术发展概况  10-11
2 材料与方法  11-14
  2.1 植物材料  11
  2.2 农杆菌菌株及载体  11
  2.3 转化方法  11-12
  2.4 培养条件  12
  2.5 生根和移栽  12
  2.6 叶片再生不定芽效率和转化效率的评价指标及方法  12-13
    2.6.1 叶片再生不定芽效率的评价指标及方法  12
    2.6.2 转化效率的评价指标及方法  12-13
  2.7 转化植株的鉴定  13-14
    2.7.1 GUS分析  13
    2.7 2 Km抗性分析  13-14
    2.7 3 Southern分析  14
3 结果与分析  14-31
  3.1 苹果试管苗叶片离体再生不定芽的研究  14-22
    3.1.1 苹果叶片再生不定芽的形态学观察  14-15
    3.1.2 基本培养基对苹果叶片再生的影响  15
    3.1.3 培养基中糖的种类和浓度对苹果叶片再生的影响  15-16
    3 1.4 培养基中激素对苹果叶片再生的影响  16-20
    3.1.5 暗培养对苹果叶片再生的影响  20-21
    3.1.6 叶片接种方向对新乔纳金叶片再生的影响  21
    3.1.7 抗生素对苹果叶片再生的影响  21-22
  3.2 农杆菌介导的苹果遗传转化中影响因素的研究  22-29
    3.2.1 苹果基因型对基因转移的影响  22-23
    3.2.2 vir基因诱导因子对新乔纳金转化的影响  23-24
    3.2.3 叶片在菌液中浸泡时间对新乔纳金转化的影响  24-25
    3.2.4 共培养时间对新乔纳金转化的影响  25
    3.2.5 共培养时叶片放置方向对新乔纳金转化的影响  25-26
    3.2.6 共培养时滤纸层对新乔纳金转化的影响  26-27
    3.2.7 推迟选择对新乔纳金转化的影响  27-28
    3.2.8 继代苗苗龄对其叶片转化的影响  28
    3.2.9 菌株类型对新乔纳金转化的影响  28-29
  3.3 转基因植株的获得及鉴定  29-31
    3.3.1 转化体的获得  29-30
    3.3.2 转化植株的Km抗性鉴定  30-31
    3.3.3 转化植株的GUS分析  31
    3.3.4 Southern印迹分析  31
4 讨论  31-36
  4.1 本研究建立的新乔纳金苹果遗传转化系统的特点  31-33
  4.2 利用GUS基因瞬时表达结果来优化基因转移系统的问题  33
  4.3 叶片离体再生不定芽的调控问题  33-34
  4.4 暗培养和TDZ作用机理的探讨  34-36
5 小结  36-37
参考文献  37-45
图版及其说明  45-50
英文摘要  50-53
致谢  53

苹果叶片离体再生不定芽及遗传转化的研究

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