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活血化瘀中药和单体对SScFb增殖和Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因转录影响的研究

作　者: 吕小岩
导　师: 翁孟武；李明
学　校: 复旦大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 系统性硬皮病成纤维细胞前胶原转化生长因子β1 活血化瘀中药中药单体
分类号: R259.9
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

系统性硬皮病（Systemic Sclerosis，SSc）是以皮肤和内脏器官纤维硬化为主要表现的结缔组织疾病，目前该病发病机制尚未完全清楚，治疗效果欠佳。本文重点在病因方面研究成纤维细胞（fibroblasts，Fb）在其发病环节中的作用，探讨患者成纤维细胞胶原代谢方面的异常和细胞因子TGF—β₁与此异常的关系；治疗方面研究活血化瘀中药及中药单体对SSc患者FbⅠ、Ⅲ型前胶原基因转录的影响。首先，建立了来自SSc患者和正常对照的Fb原代培养细胞各五株。比较了两种细胞基本的生物学特点，SSc组和对照组的一代生长期相似，潜伏期约为48h，指数增殖期为48～96h，停滞期为120～168h。两组的生命期也无明显差异，共可传约30代左右。所以SSc组Fb并无特殊的生长增殖特点，同正常Fb一样经历一定的生长增殖过程后，衰老死亡。其次，探讨SSc患者FbⅠ型前胶原基因表达的特点，细胞自身分泌的转化生长因子TGF—β₁是否是Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）mRNA表达增高的原因。采用核酸原位杂交和免疫印迹法分别测定培养的硬皮病和正常人Fb中COL1A1mRNA的表达和TGF-β₁蛋白质的含量。结果提示硬皮病组FbCOL1A1 mRNA（光密度值905.09±20.36）表达较对照组（354.17±30.89）明显增高。硬皮病组和对照组Fb的COL1A1 mRNA表达均存在异质性，硬皮病组COL1A1 mRNA高表达的Fb数（27.33％±4.63％）明显高于对照组（3.67％±1.20％），而对照细低COL1A1 mRNA表达的Fb数（62.33％±3.53％）明显高于硬皮病组（14.33％±4.91％）。硬皮病组内各细胞株间，高、中、低胶原表达的细胞数并无明显差别。硬皮病组和对照组Fb中TGF-β₁蛋白质表达无显著差别。所以SScFbⅠ型胶原mRNA表达表达较对照明显增多且存在异质性，但是这种表达增多可能不是由于Fb自身合成TGF-β₁增多。最后，研究活血化瘀中药和中药单体对SSc患者Fb增殖和Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因表达的影响，以期筛选出一些可以影响其表达的中药和中药单体。首先采用MTT法分析药物对Fb增殖的影响。先以台盼蓝染色法结合直接镜检法确定了各种药物的大致ID₅₀浓度，随后又选择了其中的部分药物取其ID₅₀／10浓度作用于细胞，并观测其作用后1天、3天、6天对细胞生长增殖的影响。其中中药水煎剂红花对增殖抑制最早24h就发挥作用，赤芍和茜草作用时间约在72h时可对细胞增殖有轻微抑制，当归在此浓度下对细胞增殖无影响。丹参注射液作用24h可以轻微促进细胞增殖，随后才产生抑制作用。中药单体中丹参多酚酸盐和复旦大学博士研究生毕必论久月参酮IIA作用24h对细胞增殖无影响，之后随时间延长在72h检测产生增殖抑制作用。CRA、CRP、原儿茶醛、积雪草试对细胞增殖抑制发生时间较晚在6天左右。月1参素钠在24h时轻度促进细胞增殖，随后在144h时测定其对增殖有抑制作用。红景天试此浓度对细胞生长增殖没有影响。总之，中药红花、茜草、赤芍水煎剂和月一参注射液，中药单体月一参多酚酸盐、月一参酮IIA、原儿茶醛、月一参素钠、积雪草试、CRA、CRP对细胞生长增殖具有一定的抑制作用。继而，采用RT一PCR方法分析了SSc组和正常组I、111型前胶原基因表达的差别，SSc组I型前胶原mRNA表达约是对照组的2倍，m型约是对照组的1.8倍。以所选药物干预后，丹参注射液作用于Fb24h后，能显著抑制I、m型前胶原mRNA的表达，I型减少64%，111型减少60%，对I型前胶原基因转录抑制稍强。赤芍、茜草水煎剂能够同等程度抑制I、m型的基因转录，使其大约减少30%左右。红花水煎剂对所测基因转录未发现有抑制作用。中药单体中积雪草试很显著抑制SSc患者的Fb前胶原mFNA表达，使I型表达减少55%，111型减少45%，提示其可能具有很好的抗纤维化作用。自丹参提取的4种单体都显示有一定的抑制胶原基因表达的作用，其中丹参酮IIA最强，可以使I型减少47%，Hl型减少45%。其次为丹参素钠，使I型减少41%，H工型减少36%。第三是丹参多酚酸盐，使I型减少35%，H工型减少32%。最后为原儿茶醛，可使I型减少29%，IH型减少38%。金雀根的单体成分中CRA、CRP也具有抑制作用，两者的抑制程度类似，均可以使I型、工H型减少约20%。而红景天试在此浓度下未发现有抑制工、工H型前胶原n1RNA表达的作用。综上所述，从对己经长期用于治疗SSC并有一定疗效的活血化癖中药中选取的丹参、茜草、赤芍的细胞和分子药理机制方面的研究结果显示，丹参、茜草、赤芍能够抑制SSCFb增殖和工型、IH型前胶原mRNA表达，这可能是其能够有效治疗SSc的原因之一。对其中的部分有效成分的深入研究结果显示，单体积雪草试、丹参酮工IA、丹参素钠、丹参多酚酸盐、原儿茶醛、CRA、CRP不仅对SScFb增殖具有一定的抑制作用，而且能够减少I型、工H型前胶原mRNA表达，具有应用于临床的价值和前景，今后可进一步进行相关的动物或人体实验，为临床应用奠定基础。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
第一部分系统性硬皮病成纤维细胞生长及增殖特性  12-20
  材料和方法  12-14
  结果  14-15
  讨论  15-17
  图片  17-20
第二部分 SSc FbⅠ型胶原mRNA表达与转化生长因子β_1关系的研究  20-30
  材料和方法  20-25
  结果  25-26
  讨论  26-29
  图片  29-30
第三部分活血化瘀中药及单体对SScFb增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响  30-54
  一活血化瘀中药及单体对Fb增殖的影响  31-41
    材料和方法  31-33
    结果  33-36
    讨论  36-40
    图片  40-41
  二活血化瘀中药及单体对SSc FbⅠ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响  41-54
    材料和方法  41-45
    结果  45-46
    讨论  46-51
    图片  51-54
全文结语  54-55
参考文献  55-59
创新之处  59-60
综述: β-转化生长因子对硬皮病成纤维细胞影响的研究进展  60-66
综述: 抗纤维化药物对系统性硬皮病成纤维细胞影响的研究进展  66-72
发表文章及获奖情况  72-73
致谢  73-74

活血化瘀中药和单体对SScFb增殖和Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因转录影响的研究

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