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共表达及染色体上表达折叠调节因子对外源蛋白功能性表达影响的研究

作　者: 白光兴
导　师: 俞炜源
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 分子伴侣 GroEL-S Dsb家族分子 DsbC 基因敲入功能性表达
分类号: Q753
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 62次
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内容摘要

大肠杆菌在基因工程的研究中应用极为广泛，然而在表达外源蛋白时常遇到的问题是表达产物不能正确折叠，以没有功能活性的包涵体形式存在，而包涵体的体外复性是一个困难而复杂的过程。因此提高外源蛋白在大肠杆菌中的功能性表达有很现实的意义。蛋白的折叠大多需要分子伴侣的协助才能完成，其中有两类分子伴侣对蛋白的折叠有重要的影响。第一类是DnaK-DanJ，第二类是GroEL-GroES。对于含二硫键的蛋白，还需要Dsb家族分子的参与，才能形成正确的二硫键。为观察这些折叠调节因子对外源蛋白的功能性表达的影响，我们用PCR方法从大肠杆菌的染色体上分离了分子伴侣DnaK，DnaJ，GroEL和GroES的基因，以及Dsb家族分子中的DsbA和DsbC分子的基因，同时根据文献报道，采用重叠延伸PCR方法构建了DsbA和DsbC的两个突变体基因，将上述基因分别克隆到表达载体上。以富含二硫键的尿激酶(UK)作为研究对象，来研究共表达及整合在染色体的折叠调节因子对富含二硫键的蛋白功能性表达的影响。尿激酶的活性用纤维蛋白溶解试验测定。结果表明单独的UK在大肠杆菌BW25113和HB101中的表达产物没有活性。将上述折叠调节因子分别与UK在大肠杆菌BW25113中共表达，除DnaJ以外，其他的分子都观察到具有促进UK功能性表达的作用，其中效果最明显的是GroEL-GroES；在HB101中共表达，只观察到GroEL-S和DsbC有促进UK功能性表达的作用。将筛选到的对UK的功能性表达有促进作用的GroEL-S和DsbC基因，利用Red同源重组技术，分别整合到大肠杆菌HB101的galK基因位置，将这两个菌株命名为HB-G(galK∷groEL-S)和HB-C(galK∷dsbC)。将UK在改造后的菌株中表达，在整合了DsbC的HB-C菌株中观察到了促进UK功能性表达的作用，效果与UK在野生型的HB101中共表达DsbC相当；而整合了GroEL-S的菌株HB-G则没有明显的促进UK功能性表达的作用。将UK在HB-C中共表达GroEL-S，UK的功能性表达有了显著的提高，是在野生型的HB101中共表达GroEL-S时的4倍，是共表达DsbC时的17倍。整合的DsbC与共表达的GroEL-S对UK的功能性表达显示出了较强的协同作用。这表明，在HB-C中，整合在染色体上的DsbC对含二硫键的外源蛋白的功能性表达军事医学科学花之博士学位创仑文中文摘要有促进作用，与GroEL一S联合作用效果更为明显。而UK在整合了GroEL一S的菌株中与DsbC共表达，与在野生型的HB 101中共表达DsbC的功能性表达水平没有明显差异。其原因可能是染色体上单拷贝基因的表达量较低，少量的分子伴侣难以观察到对外源蛋白明显得促进作用。而DsbC是二硫键异构酶，具有酶的高效作用特点，催化二硫键的重排，可能较少的量就能观察到明显的效果。本研究建立了在大肠杆菌染色体上进行基因敲入的方法，观察了共表达及敲入到染色体上的折叠调节因子对外源蛋白功能性表达的影响，获得了对外源蛋白的功能性表达有促进作用的菌株。为改造大肠杆菌，提高外源蛋白的功能性表达作了初步的探索。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-17
第一部分共表达折叠调节因子对尿激酶功能性表达的影响  17-36
  材料与方法  18-22
  结果  22-32
  讨论  32-34
  小结  34-36
第二部分整合在染色体上的折叠调节因子对尿激酶功能性表达的影响  36-63
  材料与方法  38-44
  结果  44-58
  讨论  58-61
  小结  61-63
总结  63-65
致谢  65-66
附件1  66-74
附件2  74-76

共表达及染色体上表达折叠调节因子对外源蛋白功能性表达影响的研究

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