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n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖的影响及fat-1转基因小鼠打靶载体的构建

作 者: 郑征
导 师: 葛银林
学 校: 青岛大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: n-3多不饱和脂肪酸 fat-1基因 基因敲入 PNS Cre-LoxP
分类号: R151.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


脂肪酸是维持人体正常生理功能的必须物质,分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。n-3多不饱和脂肪酸是一类备受医学届关注的多不饱和脂肪酸,已证明它的摄入具有抗肿瘤和防治代谢类疾病的作用。本实验第一部分将健康小鼠分为高饱和脂肪酸饮食组、n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组,记录每周小鼠进食量和体重,用ELISA法检测小鼠血清脂联素、增食因子A、抵抗素水平,来研究n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖程度及相关细胞因子血清水平的影响。结果发现n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的肥胖程度明显低于高饱和脂肪酸饮食组小鼠(P<0.05),增食因子A和抵抗素的血清水平明显低于高饱和脂肪酸饮食组小鼠(P<0.05),脂联素的血清水平低于高饱和脂肪酸饮食组小鼠但无统计学差异;n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的各项指标和对照组均无统计学差异。因此认为n-3多不饱和脂肪酸饮食和高饱和脂肪酸饮食相比,在为提供小鼠必需脂肪酸摄入的同时,更不易诱导肥胖的发生和发展。虽然摄入n-3多不饱和脂肪酸的生理功效已获得了医学届的认可,但大量获得高纯度的n-3多不饱和脂肪酸,特别是DHA和EPA的成本依然很高。如果将能表达n-3多不饱和脂肪酸的基因或编码能将体内其它物质转化为n-3多不饱和脂肪酸的酶的基因,通过转基因的方法导入到常见的经济动物,如猪、牛、羊体内,使人们在一日三餐中即可进行n-3多不饱和脂肪酸的补充,将是一种解决大量获得高纯度的n-3多不饱和脂肪酸较困难现状的有效途径。在线虫体内发现的fat-1基因,可编码n-6多不饱和脂肪酸脱氢酶,该酶可将n-6多不饱和脂肪酸转化为n-3多不饱和脂肪酸,从而改变体内多不饱和脂肪酸比例。由于小鼠繁育较快,利用基因打靶技术获得转基因小鼠相对容易,因此首先获得fat-1转基因小鼠,对于利用fat-1基因来优化经济动物的性状,从而获得大量含有n-3多不饱和脂肪酸的肉、蛋、乳制品具有前瞻性意义。本实验第二部分,我们对fat-1基因进行密码子优化,增强该基因在小鼠体内的高效表达,把带有启动子和加尾信号的fat-1基因作为一个表达盒整合到通用打靶载体pSSC-10上,之后在小鼠第11号染色体脂肪酸脱氢酶域家族6下游的DNA序列上找到一段基因空白区,依据GenBank上提供基因序列采用Primer5软件设计两对引物,以C57BL/6小鼠肝组织提取的DNA为模板,分别扩增长为3.4kb和1.4kb的片段作为同源短臂(SA)和同源长臂(LA)。再分别将同源长短臂克隆入pSSC-10-fat-1中间载体上fat-1表达盒的两侧,构建出可在细胞水平筛选并剔除筛选标记的基于PNS系统的fat-1转基因小鼠敲入型打靶载体。经酶切鉴定和DNA测序鉴定,我们认为所构建的基因敲入载体pSSC-10-fat-1-SA-LA可以作为下一步转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞,进而获得fat-1转基因小鼠的合适载体。

全文目录


摘要  2-4
ABSTRACT  4-9
引言  9-11
第一部分 n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖的影响  11-19
  第一部分 第一章 实验材料  11-13
    1.1.1 实验器材  11
    1.1.2 实验动物  11
    1.1.3 饲料配方  11-12
    1.1.4 样本和试剂  12
    1.1.5 常用软件  12-13
  第一部分 第二章 实验方法  13-14
    1.2.1 小鼠每周体重和进食量的测定  13
    1.2.2 细胞因子检测  13
    1.2.3 数据统计  13-14
  第一部分 第三章 实验结果  14-16
    1.3.1 三组小鼠每周增重、每周进食量及体重体长比的差异  14-15
    1.3.2 三种细胞因子血清水平与饮食类型的关系  15-16
  第一部分 第四章 实验讨论  16-18
  第一部分 结论  18-19
第二部分 fat-1转基因小鼠打靶载体的构建  19-41
  第二部分 第一章 实验材料  19-21
    2.1.1 实验器材  19
    2.1.2 试剂及基因工程酶类  19-20
    2.1.3 质粒、菌种、引物合成、测序及基因合成  20
    2.1.4 组织样本  20
    2.1.5 常用软件及数据库  20-21
  第二部分 第二章 实验方法  21-31
    2.2.1 中间载体pSSC-10的构建  21-24
      2.2.1.1 构建策略  21
      2.2.1.2 多克隆位点序列的合成  21-22
      2.2.1.3 通用载体pSSC-9的酶切  22
      2.2.1.4 酶切载体pSSC-9后的凝胶回收  22
      2.2.1.5 酶切后的载体pSSC-9和添加的MCS连接  22-23
      2.2.1.6 感受态细胞的制备和重组质粒的转化  23
      2.2.1.7 阳性克隆的筛选  23-24
    2.2.2 中间载体pCMV-fat-1的构建  24-26
      2.2.2.1 构建策略  24-25
      2.2.2.2 含有fat-1基因的克隆载体pMD18-T Vector和pEGFP-N1的双酶切  25
      2.2.2.3 分别将凝胶电泳分离的fat-1基因和pEGFP-N1片段进行凝胶回收  25
      2.2.2.4 酶切的fat-1基因和pEGFP-N1片段的连接  25
      2.2.2.5 重组质粒的转化  25
      2.2.2.6 阳性克隆的筛选  25
      2.2.2.7 引入LoxP位点和BamHI位点  25-26
    2.2.3 基因敲入载体pSSC-10-fat-1-SA-LA的构建  26-31
      2.2.3.1 构建策略  26-27
      2.2.3.2 中间载体pSSC-10和pCMV-fat-1的双酶切  27
      2.2.3.3 分别将凝胶电泳分离的pSSC-10和pCMV-fat-1片段进行凝胶回收  27
      2.2.3.4 酶切的pSSC-10和pCMV-fat-1片段的连接  27
      2.2.3.5 重组质粒的转化  27
      2.2.3.6 阳性克隆的筛选  27
      2.2.3.7 小鼠基因组DNA的提取  27
      2.2.3.8 钓取同源臂所用引物的设计  27-28
      2.2.3.9 用PCR法钓取同源短臂  28-29
      2.2.3.10 PCR产物的纯化  29
      2.2.3.11 将纯化后的同源短臂连接至TA克隆载体  29
      2.2.3.12 重组质粒的转化  29-30
      2.2.3.13 阳性克隆的筛选  30
      2.2.3.14 中间载体pSSC-10-fat-1和pMD19-SA的双酶切  30
      2.2.3.15 分别将凝胶电泳分离的pSSC-10-fat-1和同源短臂片段进行凝胶回收  30
      2.2.3.16 重组质粒的转化  30
      2.2.3.17 阳性克隆的筛选  30
      2.2.3.18 同源长臂的钓取、TA克隆、连接  30-31
  第二部分 第三章 实验结果  31-36
    2.3.1 中间载体pSSC-10的酶切鉴定和测序鉴定  31
    2.3.2 中间载体pCMV-fat-1的酶切鉴定和测序鉴定  31-32
    2.3.3 打靶载体pSSC-10-fat-1-SA-LA的酶切鉴定和测序鉴定  32-36
      2.3.3.1 中间载体pSSC-10-fat-1的鉴定  32-33
      2.3.3.2 中间载体pSSC-1O-fat-1-SA的鉴定  33-34
      2.3.3.3 打靶载体pSSC-10-fat-1-SA-LA的鉴定  34-36
  第二部分 第四章 讨论  36-40
    2.4.1 提高中靶胚胎干细胞的筛选效率  36
    2.4.2 增强fat-1基因在真核细胞中的表达  36-37
    2.4.3 获得中靶干细胞后,在细胞水平剔除Neo抗性标记  37-38
    2.4.4 fat-1基因的预期的生理效应  38-40
  第二部分 结论  40-41
参考文献  41-43
综述  43-50
  参考文献  48-50
攻读学位期间的研究成果  50-51
致谢  51-52

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 营养学 > 合理营养
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