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过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力
作 者: 黄芬
导 师: 李力;童贻刚
学 校: 陕西师范大学
专 业: 水生生物学
关键词: HSP70 分子伴侣 CHO细胞 抗体
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
在漫长的生物进化过程中,热休克蛋白是生物体保留下来的可用于对抗外界损害并能够进行自我保护的重要机制之一。热休克蛋白是在温度升高或者其他的应激条件下(缺氧,低温或者辐射等)通过热休克基因所编码的一类在生物进化过程中最为保守的伴随细胞蛋白。热休克蛋白70的家族种类最多,一共有21种蛋白质,因此也就成为了在热休克蛋白家族中研究最多的一种,它们主要参与了蛋白质的折叠,组成相应的蛋白亚基以及降解没用的蛋白质等过程,还能够调节和稳定靶细胞的活性及功能,但它们本身却不参与目的蛋白(靶蛋白)的组成,所以热休克蛋白的重要作用是“分子伴侣”的作用。该作用主要表现在促进蛋白质的折叠、转运及组装;保护及稳定细胞结构;呈递抗原帮助细胞免疫以及肿瘤免疫等,还能够恢复和加快清除细胞内已经变性的蛋白质,能使细胞产生耐受使之更能适应环境的变化。多年来的研究发现HSP70能够抑制细胞凋亡(当然还有些研究证明了HSP70能够促进细胞的调亡),促进细胞的增殖,使生物体获得耐热性或者耐药性从而达到保护细胞的作用,因此有关研究人员分析是否可以通过增加细胞内HSP70蛋白的表达来促进细胞内分泌性蛋白即抗体的产生。本研究是通过在中国仓鼠卵巢组织细胞中过表达HSP70以提高其表达抗体的能力。其主要技术路线为:首先是通过常规PCR从中国仓鼠卵巢组织细胞的基因组DNA中扩取出HSP70基因;然后再将所扩取的HSP70基因连接到克隆载体pEASY-B中,构建成克隆质粒pEASY-HSP70;再将此克隆质粒在大肠杆菌DH5a的感受态细胞中转化,挑取数个单克隆经过夜摇菌提质粒后进行双酶切鉴定及测序鉴定,将鉴定正确的质粒经双酶切把目的基因HSP70纯化回收后连接到真核表达载体pcDNA3.1中,构建成表达质粒pcDNA3.1-HSP70;然后通过脂质体的介导,稳定转染到CHO/dhfr细胞中;通过RT-qPCR检测HSP70基因的过表达水平;G418加压,96孔板筛选获得过表达HSP70的稳定细胞系并将其进行扩大培养后用于后续实验。在过表达HSP70的CHO/dhfr细胞组和转染空载体pcDNA3.1的CHO/dhfr-细胞组中分别转染表达抗-HBs的质粒,ELISA检测两组细胞中表达抗-HBs的能力,并且比较两组细胞表达抗-HBs的能力。目前,人们对HSP70的功能的研究已经非常全面。本研究建立了稳定的过表达HSP70的CHO/dhfr-细胞系,经研究可被用于提高目标抗体的表达量。通过以上的实验得出下列结论:RT-qPCR结果显示转染了表达质粒pcDNA3.1-HSP70的实验组CHO/dhfr细胞的HSP70 mRNA的水平明显高于转染空载体pcDNA3.1的CHO/dhfr细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞的抗-HBs表达量高于对照组的CHO/dhfr细胞(P<0.05)。研究表明HSP70能有效的促进细胞分泌性蛋白的表达。
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全文目录
摘要 3-5 Abstract 5-10 第一部分 引言 10-20 1.1 热休克蛋白70的概述 10-11 1.2 热休克蛋白70的作用 11-16 1.2.1 HSP70作为分子伴侣 11-12 1.2.2 HSP70使细胞产生耐热性以及保护细胞 12-13 1.2.3 HSP70能够稳定细胞的结构 13-14 1.2.4 HSP70能够对抗细胞的凋亡 14-15 1.2.5 HSP70的抗细胞氧化的作用 15 1.2.6 促进细胞的增殖 15-16 1.3 HSP70的应用现状 16-20 1.3.1 DNA疫苗的发展 16-17 1.3.2 肿瘤免疫的应用 17-18 1.3.8 HSP70与炎症的联系 18 1.3.4 治疗遗传病 18-19 1.3.5 HSP70与环境监测 19-20 第二部分 构建真核表达质粒 20-34 2.1 材料 20-21 2.1.1 载体与菌株 20 2.1.2 工具酶与试剂盒 20 2.1.3 细胞的培养试剂 20 2.1.4 相关的试剂以及相关培养基的配置 20-21 2.1.5 实验仪器 21 2.2 实验方法 21-29 2.2.1 CHO/dhfr-细胞的复苏与培养 21-22 2.2.2 从CHO/dhfr-细胞中提取基因组 22-23 2.2.3 设计引物 23-24 2.2.4 扩取目的基因 24-25 2.2.5 重组质粒的构建 25-27 2.2.6 表达质粒的构建 27-29 2.3 结果 29-31 2.3.1 目的基因的扩取 29 2.3.2 重组质粒的构建 29-30 2.3.3 重组质粒的测序鉴定 30-31 2.3.4 构建的表达质粒pcDNA3.1-HSP70的双酶切鉴定 31 2.3.5 表达质粒的测序鉴定 31 2.4 结果讨论 31-34 2.4.1 提取用于转染的质粒的注意事项 31-32 2.4.2 酶切注意事项 32-34 第三部分 稳定细胞系的建立 34-46 3.1 材料 34 3.1.1 细胞的培养、转染及加压筛选试剂 34 3.1.2 待转染的质粒 34 3.1.3 实验仪器 34 3.2 方法 34-39 3.2.1 确定G418的最佳筛选浓度 34-35 3.2.2 相关的试剂的配制 35 3.2.3 稳定转染的pcDNA3.1-HSP70质粒细胞的筛选 35-36 3.2.4 RT-qPCR检测转染细胞中HSP70的过表达 36-39 3.3 结果 39-40 3.3.1 G418的最佳筛选浓度的选择 39 3.3.2 转染细胞中HSP70基因的PCR鉴定 39-40 3.3.3 RT-qPCR检测转染细胞中HSP70的过表达 40 3.4 结果讨论 40-46 3.4.1 筛选之前确定G418的浓度 40-41 3.4.2 确定G418的最佳筛选浓度的结果分析 41 3.4.3 分析在进行转染时需要注意的因素 41-42 3.4.4 PCR鉴定实验组细胞中HSP70基因的分析 42 3.4.5 TRIzol法提取总RNA时需注意几点 42 3.4.6 设计RT-qPCR引物的方法和注意事项 42-43 3.4.7 RT-qPCR的检测原理 43-44 3.4.8 转染细胞中HSP70的过表达的结果分析 44-46 第四部分 转染表达抗-HBs的质粒及ELISA检测 46-52 4.1 材料 46 4.1.1 质粒与试剂 46 4.1.2 细胞及器材 46 4.1.3 仪器 46 4.2 方法 46-48 4.2.1 铺板 46-47 4.2.2 转染 47 4.2.3 ELISA检测 47-48 4.3 结果 48-49 4.3.1 ELISA检测抗-HBs的表达量 48-49 4.4 结果讨论 49-52 4.4.1 抗-HBs酶联反应试剂盒的原理 49 4.4.2 在进行酶联反应时应该注意德事项 49-50 4.4.3 ELISA检测抗-HBs表达量的结果分析 50-52 结论 52-54 参考文献 54-58 附录 58-62 致谢 62-64 攻读硕士期间研究成果 64-65 附件 65
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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